项目文章｜北林大张德强团队子刊成果，磷酸化修饰调控杨树抗旱的核心机制

干旱胁迫是限制林木生长和生存的主要环境因子，全球气候变化加剧了干旱频率和强度，导致森林退化和树木死亡。
木质部结构是水分运输的关键通道，其适应性重塑（如导管缩小、细胞壁加厚、木质素沉积）是树木应对干旱的重要策略。木质素是次生细胞壁的主要成分，其单体组成（尤其是S/G比值）影响细胞壁的疏水性和机械强度。钙信号和钙依赖性蛋白激酶（CPKs） 在植物干旱响应中发挥核心作用，但CPKs如何调控木质部重塑和木质素代谢尚不清楚。自然种群中的遗传变异（如SNP、InDel）是适应性进化的基础，但如何通过多组学整合和关联分析揭示关键调控基因仍具挑战。

2026年6月，北京林业大学张德强团队在子刊 《Science Advances 》(IF:13.9)发表文章“ Natural variation in PtoCPK3 governs drought tolerance by orchestrating xylem remodeling and lignin metabolism in Populus”。该研究依托磷酸化修饰组学，蛋白组，转录组，代谢组等多组学的整合，结合群体遗传学和功能验证，系统阐明了蛋白激酶PtoCPK3调控模块通过优化木质素代谢来提升杨树抗旱能力的等位遗传机制。北京青莲百奥生物科技有限公司为文章提供了磷酸化修饰组学和蛋白质组学检测服务。

• 多组学整合策略：结合蛋白质组、磷酸化蛋白质组、转录组、代谢组，系统解析干旱响应的多层次调控网络。

• 环境关联分析（GEA）+ 代谢物GWAS（mGWAS）：识别出与降水和干燥指数显著关联的关键基因PtoCPK3。

• 分子机制解析：揭示PtoCPK3–PtoERF72–PtoWOX13b–PtoUGT72AZ2调控模块，协同调控G型木质素单体积累和木质部结构重塑。

• 自然变异与适应性分化：发现PtoCPK3和PtoERF72的特定等位基因组合在干旱地区富集，赋予更强的抗旱能力。

研究首先对杨树进行为期15天的干旱处理，观察到植株萎蔫、木质部宽度减小及次生细胞壁显著增厚。通过广泛靶向代谢组学分析，共鉴定出395个差异积累代谢物，其中苯丙烷代谢途径在干旱下显著富集。进一步整合转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据，通过方向性P值合并（DPM）分析，鉴定出2770个干旱响应磷酸化位点，其中61.95%在三个组学层面呈现一致的变化方向，这些协同变化的基因显著富集于“木质素代谢”和“细胞壁生物发生”等通路，而黄酮合成相关基因则在三个层面均一致下调，说明干旱胁迫下，杨树将代谢流优先导向木质素合成，以强化细胞壁结构。

通过对302个杨树个体进行群体遗传分析，发现南、东北、西北三个亚群在降水和干燥指数上差异显著。基因型-环境关联分析（GEA）鉴定出大量与干旱环境显著关联的SNP，这些适应性SNP的遗传分化指数（Fst）值显著高于中性SNP，证实环境压力驱动了遗传分化。mGWAS将PtoCPK3基因上的SNP与这两种代谢物含量显著关联，且该基因同样被GEA鉴定。总之，干旱环境驱动了木质素代谢物和PtoCPK3的适应性分化，PtoCPK3是连接环境选择与木质素代谢的关键枢纽基因。

为验证PtoCPK3的生物学功能，研究构建了其过表达（OE）和敲低（KD）转基因杨树。干旱处理下，OE株系生长优于野生型，KD株系则更为敏感。木质部解剖结构分析表明，OE株系导管密度增加、导管腔面积减小、细胞壁显著增厚。更为关键的是，木质素组成分析显示，OE株系总木质素含量虽有所增加，但木质素S/G比值下降了14.35%（从2.47降至2.23）。表明PtoCPK3通过优化导管结构和调整木质素单体组成（降低S/G比值），显著增强杨树的水分运输效率和抗旱性。

为阐明PtoCPK3的下游分子机制，研究对PtoCPK3-OE株系进行定量磷酸化蛋白质组分析，鉴定出1052个差异磷酸化位点，其中491个属于干旱响应磷酸化蛋白。酵母双杂交和pull-down实验验证了PtoCPK3与转录因子PtoERF72的直接互作。体外激酶实验表明，PtoCPK3以Ca²⁺浓度依赖的方式磷酸化PtoERF72。质谱（LC-MS/MS）鉴定出Ser96为主要磷酸化位点。当将该位点突变为丙氨酸后，磷酸化几乎消失，表面等离子体共振（SPR）显示结合亲和力下降13.49倍，双分子荧光互补（BiFC）实验证实核内共定位完全丧失，表明该位点是二者核内互作及功能发挥的分子开关。

为解析磷酸化对PtoERF72功能的影响，研究构建了PtoERF72的OE和KD转基因株系。表型观察发现OE株系生长更为健壮，且木质素自身荧光信号显著增强，气相色谱-质谱（GC-MS）证实其松柏醇含量显著升高。在众多靶基因中，PtoERF72激活PtoWOX13b同时抑制PtoUGT72AZ2。PtoCPK3过表达可显著增强PtoERF72对这两个靶基因启动子的结合能力和转录调控效率；而Ser⁹⁶突变为丙氨酸后，PtoERF72对两个靶基因的结合能力分别下降了37.85%和52.85%。因此，PtoCPK3介导的磷酸化修饰增强PtoERF72的DNA结合能力和转录活性，使其能够双向调控下游靶基因PtoWOX13b和PtoUGT72AZ2。

mGWAS分析鉴定出PtoCPK3基因上的SNP226与阿魏酸和松柏醇含量显著关联，产生无功能等位型PtoCPK3ᴰ和完整功能型PtoCPK3ᴵ。同时，PtoERF72存在非同义变异，产生PtoERF72ᴬᴬ（仅Ser96）和PtoERF72ᶜᶜ（Ser96额外增加Thr126磷酸化位点）两种等位型。激酶活性检测显示PtoCPK3ᴵ具有活性而PtoCPK3ᴰ无活性；PtoERF72ᶜᶜ的磷酸化效率高于PtoERF72ᴬᴬ，对下游靶基因的调控能力也更强。地理分布分析表明，PtoCPK3ᴵ–PtoERF72ᶜᶜ组合在干旱的NE和NW地区显著富集，而PtoCPK3ᴰ–PtoERF72ᴬᴬ组合则主要分布于湿润的S地区。

总而言之，PtoCPK3和PtoERF72的功能性等位基因组合在干旱环境中被正选择，通过增强磷酸化效率和下游调控网络，赋予杨树更强的抗旱能力，为林木分子育种提供了明确的靶标。

本研究揭示了杨树抗旱的完整分子通路：干旱激活PtoCPK3，其磷酸化PtoERF72后协同PtoWOX13b抑制PtoUGT72AZ2，减少G型木质素前体的糖基化消耗，促进其聚合入木质素，降低S/G比值并强化木质部，提高抗旱性。
该研究首次建立“钙信号→磷酸化→转录调控→代谢重塑→结构强化”的抗旱级联模型，拓展了CPK激酶在木质部调控中的新功能。应用上，PtoCPK3和PtoERF72的功能性等位基因可作为分子标记，为杨树及林木抗旱育种提供精准靶标，对应对全球气候变化背景下的森林衰退具有重要现实意义。

供稿：隋馨莹

编辑：市场部

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