Nature正刊！SCIEX ZenoTOF 8600 超敏多重碎裂质谱确证人类蛋白质组“暗物质”

近些年的研究表明，人类蛋白组除了数据库收录的约19500个经典蛋白之外，还存在由全新的非经典开放阅读框（ncORF）翻译而成的蛋白/多肽产物，称之为蛋白组的暗面（Dark Proteome）。对于这些全新ncORF是否确切存在，是否具备功能，缺乏系统性的研究和评价标准。近期，由TransCODE联盟牵头，联合西雅图系统生物研究所，密歇根大学，荷兰乌得勒支玛克西玛公主儿童肿瘤中心等机构，发表在《Nature》的题为“Expanding the human proteome with microproteins and peptideins”的研究论文，系统的阐述了ncORF从存在到递呈，再到功能的证据链。通过数据库挖掘，ZenoTOF 8600靶向验证，最终锁定了15个经过校验的可信度最高的nuORF。

图1. 多组学证据强度和谱图质量人工核验相结合，将ncORF非经典阅读框判定为不同的层级

以具有核糖体测序（Ribo-seq）翻译证据的7264个ncORF为基础，此项研究挖掘了8.5万个质谱蛋白组学的数据，35亿张谱图后，发现大部分ncORF是短序列小蛋白，不易被常规蛋白组学技术鉴定到。HLA递呈的免疫多肽，是细胞内蛋白组在细胞表面的外化形式，HLA免疫多肽组的ncORF证据，可以和特异性酶切蛋白组数据互为补充。于是，此项研究进一步引入1万个HLA免疫多肽组数据，2.4亿张谱图，佐证ncORF是否存在。SCIEX高分辨质谱平台上积累的蛋白组学和免疫多肽组学数据就是谱图证据的来源之一。于是，基于Ribo-seq，蛋白组，免疫多肽组的多组学数据，结合谱图质量的人工核验，此项研究建立了ncORF的分级系统。根据证据的充分性由高到低，依次分为Tier 1 ~ 4不同层级 (图1) 。

图2. ZenoTOF 8600靶向蛋白组学验证Tier 1A多肽c11riboseqorf4。P1，P2：分别采用盐酸胍提取和乙腈沉淀两种方法制备样品；Light：三种细胞的内源c11riboseqorf4多肽；Heavy：重标多肽内标物

在分级系统中，尽管多组学数据库证据充分支持Tier 1A ncORF，实验验证依然是ncORF筛选漏斗中的关键一环。此项研究采用ZenoTOF 8600高分辨质谱平台，在三个细胞系中验证了与已知人类蛋白PIDD1重叠的c11riboseqorf4 ncORF。将6 fmol同位素重标多肽标准品，掺入250ng细胞酶解产物。使用搭载OptiFlow Pro 全流速离子源和纳升液相的ZenoTOF 8600系统，采用MRM^HR靶向数据采集方法，即选定预设的目标肽段母离子进行碎裂，碎裂后所有的子离子都送入高分辨ZenoTOF进行全扫描检测。实验发现，采用盐酸胍和乙腈沉淀两种方法制备的细胞样品中，均能检测到内源的c11riboseqorf4多肽，碎片离子的谱图特征与重标多肽内标物完全吻合（图2）。经过数据库挖掘和实验确证，c11riboseqorf4现在验证为是功能性蛋白，已经被收录到了主流数据库如UniProtKB。

图3. ZenoTOF 8600 靶向蛋白组学验证Tier 2A 多肽c11norep190。P2：采用乙腈沉淀大分子蛋白，上清富集小蛋白的方法制备样品；Light：三种细胞的内源c11riboseqorf4多肽；Heavy：重标多肽内标物

对于蛋白组和免疫多肽组证据薄弱的Tier 2A多肽，可采用类似的靶向方法进行验证。Tier 2A c11norep190多肽是位于H2AX基因的下游ORF，仅有的肽段支持证据是大脑额叶皮层蛋白组数据库，而转录组研究则显示该蛋白在各类组织中广泛表达。ZenoTOF 8600 MRM^HR靶向分析，发现使用乙腈沉淀法（P2）分离提取细胞中的小蛋白，可以在Hela S3, HEK293, K562细胞中鉴定到Tier 2A c11norep190多肽（图3）。

ZenoTOF 8600极速超敏多重碎裂质谱介绍

作为蛋白质组学通用平台，ZenoTOF 8600为暗物质新蛋白的确证提供清晰，可靠的高分辨质谱证据。搭载高效的离子传输组件，Zeno Trap离子富集技术，灵敏的新型光学检测器，ZenoTOF 8600擅长鉴定含量低，易受基质干扰的目标多肽， 确证复杂生物样品的非经典阅读框ncORF。暗物质蛋白的发现和确证，能够加深我们对疾病起源的理解，锁定新的免疫治疗靶点，加速新药研发。

图4. ZenoTOF 8600极速超敏多重碎裂质谱系统

SCIEX新一代ZenoTOF 8600高分辨质谱系统搭载了全流速范围的OptiFlow Pro离子源，DJet/QJet离子传输组件，Zeno Trap阱和混合型检测器，灵敏度得到10倍以上的提升，结合碎片离子自动筛选及加和定量分析的HRMS定量流程实现超高灵敏度、高效快速的靶向多肽定量分析。