《Analysis of Sialic Acid Linkage in N-Linked Glycopeptides Using Liquid Chromatography−Electron-Activated Dissociation Time-of-Flight Mass Spectrometry》
作者围绕N-连接糖肽中唾液酸（Sa/Neu5Ac）连接方式的鉴定展开，核心建立了 反相高效液相色谱（RP-HPLC）结合热电子捕获解离（hot ECD）的联用方法，实现了无需唾液酸衍生化的 N - 糖肽分离与唾液酸连接方式同步鉴定，解决了传统方法中分离效果差、需衍生化、碎片化信息不足的问题，同时实现了肽骨架测序与糖基化修饰分析的同步进行。
研究首先针对 N - 糖肽的分离难题，优化了反相 HPLC 的实验条件：通过将流动相中的甲酸浓度提升至0.3% 及以上，有效减弱了次级离子相互作用，实现了不同唾液酸连接方式的 N-糖肽异构体的基线分离，同时提升了检测灵敏度，甚至可检测到传统条件下未检出的四唾液酸化糖肽。
图1. 胎球蛋白糖肽的液相色谱分离：LCPDCPLLAPLNDSR在α(2-3)唾液酸酶处理前后的对比。 蓝色曲线显示脱唾液酸酶处理前，带有不同聚糖的选定离子的提取离子色谱图：(a) A2Sa2，(b) A2Sa，(c) A2Sa0。粉色曲线显示经 α(2-3) 唾液酸酶处理后的前体离子 XIC 图，处理后 α(2-3) 连接的唾液酸被去除，而 α(2-6) 连接的唾液酸保持键合。峰上方的数字表示 α(2-3) 唾液酸连接的数量。
在碎裂技术方面，研究对比了CID、常规ECD和hot ECD对N-糖肽的裂解效果。CID以产生聚糖的B型氧鎓离子为主，C型离子丰度极低，且无法区分唾液酸连接方式，也几乎无肽骨架碎片。常规ECD（Ke≈0 eV）主要产生肽骨架的c和z碎片，聚糖碎片化程度低，可实现肽骨架测序但难以分析糖基化修饰。hot ECD（电子束能量 Ke≈7-10 eV） 兼具两者优势，既能高效裂解肽骨架实现测序，又能产生丰富的聚糖碎片，且其产生的C型离子丰度与B型离子相当，而C型离子的丰度差异正是区分唾液酸连接方式的关键。
研究发现，hot ECD产生的Sa-Gal相关C型离子（m/z 472）与B型离子（m/z 454）的丰度比可作为唾液酸连接方式的诊断参数：α(2,3) 连接的糖肽中该比值显著更高，α(2,6) 连接的糖肽中该比值极低，且该诊断参数在7-10 eV的Ke范围内稳定性好。为验证方法的有效性，研究选取了两种N-糖肽标准品（QA-Bio：双 α(2,6) 连接；Asparia：双 α(2,3) 连接）和蛋黄糖肽（与标准品具有相同的肽骨架 KVANKT）进行验证，蛋黄糖肽的诊断参数与 α(2,6) 连接标准品高度吻合，且存在少量 α(2,3) 连接的贡献。
图2. 聚糖碎片强度（经初始前体强度归一化）对电子束能量的依赖性。 蓝色曲线表示α(2-6) 连接的标准品（QA-Bio），粉色曲线表示α(2-3) 连接的标准品（Asparia）。(a-d) B型离子，(e-h) C型离子。
图3. 使用hot ECD， 样品为KVANKT标准品。(a) 图3c和3g的组合电子束能量扫描图谱。实线显示作为参考的B型离子，虚线显示C型离子。(b) 按照方案1所示的诊断比率重新绘制的数据。蓝色菱形和粉色正方形分别代表QA-Bio标准品（α2-6连接）和Asparia标准品（α2-3连接）。红色圆圈显示蛋黄提取物的相同绘图。
研究将RP-HPLC-hot ECD 联用方法应用于牛胎球蛋白胰蛋白酶酶解产物的 N - 糖肽分析，实现了不同糖基化位点、不同天线数唾液酸化聚糖的连接方式鉴定：对于 A2Sa2 型聚糖，反相 HPLC 分离出的三个峰分别对应双 α(2,6)、α(2,3)+α(2,6)、双 α(2,3) 连接，诊断参数呈现阶梯式变化；对于 A2Sa 型聚糖，两个分离峰分别对应 α(2,6) 和 α(2,3) 连接，且 α(2,6) 连接的丰度更高；对于 A3Sa3 型聚糖，分离出至少 8 个峰，诊断参数的四步变化对应三种唾液酸中 0、1、2、3 个 α(2,3) 连接的组合，还发现了未被报道过的全天线为 Gal (Sa-) GlcNAc 结构的 N - 聚糖，为糖基化结构研究提供了新线索。
此外，作者还探究了肽骨架长度对鉴定的影响：对于长肽骨架的 N - 糖肽，Sa-Gal 相关的特征诊断峰（m/z 454、472）丰度极低，无法直接用于分析，需改用丰度更高的 657-675 离子对进行粗略诊断，说明肽骨架长度会影响方法的适用性，需进一步优化。同时，研究发现 CID 虽也能产生少量与唾液酸连接方式相关的 C 型离子差异，但远不如 hot ECD 的碎片丰度差异显著，因此 hot ECD 是更优的选择。
图4. 在 LC-hot ECD 工作流程中表征 α(2-3) 和 α(2-6) 连接方式的验证。样品为胰蛋白酶消化胎球蛋白中所含的电荷态 z = +4 的 LCPDCPLLAPLN[A2Sa2]DSR 前体。(a) 电荷还原物种谱，用于表示每种连接方式的相对丰度，该结果已在图 2 中得到验证。(b) 诊断峰强度谱图。(c) 根据 (b) 计算得到的诊断参数。
《Sialic Acid Linkage Identification in Glycosylated Peptides Using Multitandem Collision-Induced and Electronically Excited Dissociation Mass Spectrometry》
该研究聚焦于建立一种适用于N-糖基化和O -糖基化肽段、游离聚糖的通用唾液酸（Sa）连接方式鉴定方法，核心采用CID-EED联用的MS³策略，实现了无需衍生化的唾液酸α(2,3) 与α(2,6) 连接方式精准区分，且验证了方法在天然糖肽和糖蛋白中的实用性。
首先选取了四种合成的标准聚糖（N23、N26型N-聚糖，O23、O26型O-聚糖）和两种N-糖肽标准品（N23-GP、N26-GP），搭建ZenoTOF 7600质谱平台，实现多阶段串联质谱（MSⁿ）操作，优化了CID与EED的实验参数。核心实验思路为：通过CID从糖肽 / 糖蛋白中裂解产生SaGalHexNAc片段（该片段为唾液酸化聚糖的强丰度特征片段，m/z 657.234），将其作为MS³的靶向离子进行分离，再对该片段施加EED，通过特征碎片离子的差异判断唾液酸连接方式。
研究发现，EED对SaGalHexNAc片段的裂解具有连接方式特异性：在N-聚糖中，α(2,3) 连接的唾液酸经 EED 后会产生特征性的自由基Z₂碎片离子（m/z 349.136），还伴随其脱羟基产物（m/z 332.134）；而 α(2,6) 连接的唾液酸中，Z₂碎片离子的丰度可忽略不计，仅能检测到非自由基的Z₂±H产物。通过电子束能量梯度实验进一步验证，α(2,3) 连接对应的Z₂碎片离子在10 eV时丰度达到最大值，其脱羟基产物则在14 eV达到峰值，证明脱羟基是Z₂产生后的次级反应，需要额外的能量驱动。
图5. 两种 N-糖肽标准品的三级质谱（MS³）分析
图6. 三级质谱中电子束能量 (Ke) 梯度实验：N-糖肽标准品经CID→筛选m/z 657→EED裂解
针对游离聚糖标准品，研究证实CID可选择性去除其还原端C1位的羟基，产生与天然糖肽 / 糖蛋白中CID裂解产物结构一致的SaGalHexNAc片段，解决了游离标准品与天然样品的结构匹配问题。同时，通过正相液相色谱（HILIC）实现了聚糖标准品α/β异头物的分离，探究了CID能量和去簇电位（DP）对游离聚糖产生目标碎片的影响，发现10 eV左右的CID能量和150 V的DP能高效获得目标碎片，且α异头物的裂解效率高于β异头物，O-聚糖标准品的裂解效率高于N-聚糖标准品。在O-聚糖的应用中，该方法虽能通过Z₂碎片离子区分α(2,3) 与α(2,6) 连接，但特异性不如N-聚糖，且O-聚糖的Z₂/Y₂丰度比受异头物影响，因此需要结合O23、O26标准品进行校准，同时需对异头物进行分离后再分析。
研究将建立的方法成功应用于天然糖肽和糖蛋白样品：蛋黄糖肽中唾液酸以α(2,6) 连接为主，与已有研究结论一致；牛胎球蛋白的三个N-糖基化位点中，不同天线数的唾液酸化聚糖存在α(2,3) 与α(2,6) 的混合连接，诊断值的阶梯变化可直接反映α(2,3) 连接的唾液酸数量；人促红细胞生成素（EPO）的单唾液酸化N-聚糖仅检测到α(2,3) 连接，双唾液酸化N-聚糖则存在单α(2,3) 和双α(2,3) 两种连接形式；牛胎球蛋白的O-聚糖中仅检测到 α(2,3) 连接的唾液酸，未发现α(2,6) 连接的相关证据。
此外，研究还分析了MS³操作的离子产率，目前目标诊断离子Z₂的总产率仅为0.03%，但可通过Zeno阱脉冲技术将信号增强约10倍，提升检测的信噪比，满足实际样品分析的统计置信度要求。
图7. (a) 正相液相色谱对聚糖标准品中异头体的分离结果；(b) 各聚糖标准品的β- 异头体 (b1) 和α-异头体 (b2) 中脱水产物（质荷比657.234）的碰撞诱导解离能量依赖性；(c) 各聚糖标准品的β- 异头体 (c1) 和α-异头体 (c2) 中脱水产物（质荷比657.234）的去簇电压依赖性。
图9. 正相液相色谱分离下唾液酸连接方式的诊断峰强度（Z₂与 Y₂）
图8. 牛胎球蛋白中N-糖肽的唾液酸连接方式诊断结果
