案例分享 | 更智能的HPLC方法开发：利用计算机模拟工具提升效率

关于今年ACD/Labs举办的制药研发数字化研讨会，从预测建模到自动化与数字化工作流程，一共有8场报告。我们按照惯例对其中内容进行翻译与分享，本文为末篇。

大家好，我是Bondili，今天我的报告主题是“通过计算机模拟工具提高HPLC方法开发的效率”。

首先，我将简要介绍Pharmaron，包括公司概况与主要业务。接着，我将阐述HPLC方法开发阶段的相关背景，以及计算机模拟工具如何用于提升该过程的效率。此外，我会简要介绍我们内部整合的计算机模拟工作流程，并通过一个简要的案例说明其实际应用。最后，我将总结使用计算机模拟工具所体现的优势，以及在实际应用中需注意的相关事项。

Pharmaron是一家领先的CRO公司，为生命科学领域提供全方位服务，客户范围涵盖全球从初创生物技术公司至大型制药企业。公司员工总数超过21,000名，分布于美国、英国和中国的23个分支机构。我目前任职于英国分部。

在Hoddesdon，我们提供覆盖药物发现与开发全过程的多项服务。小分子化学团队拥有超过100名专业人员，专注于原料药与制剂研发。我目前担任原料药部门科学家，主要负责小分子API的早期开发项目。

但我在Pharmaron的职业生涯始于2023年的实习阶段。作为MChem学位的一部分，我完成了硕士研究项目，该项目也涉及将ACD/Labs软件整合至部门工作流程中。

在我实习初期，Pharmaron已经开始使用该方法开发软件，我的工作主要包括建立基于计算机模拟工具的HPLC方法开发指导原则。这也正是今天我将与各位分享的主要内容。

典型的HPLC方法开发始于分析目标概览的设定。在此阶段，需要明确所需的方法标准，例如灵敏度与精密度。ATP有助于界定方法开发的目标，并可结合分析物的其他已知属性，指导选择适宜的HPLC技术。随后，通常会对不同色谱柱与流动相进行筛选，以确定能够对分析物实现良好分离的最佳组合。在选定初始条件后，将对影响分离的关键方法参数（如pH值、温度等）进行系统优化，以进一步提升分离效果。最后，对开发完成的方法进行验证，确认其性能并证明其适用于预期目的。

传统上，该过程涉及大量手动实验，尤其在优化阶段多采用单因素优化策略。因此，该方法往往耗时较长、资源投入大，且高度依赖于色谱分析人员的经验。计算机模拟工具可用于简化这一流程。

今天我将重点介绍理化性质预测与色谱建模两项技术。理化预测有助于指导选择合适的技术，并筛除不适用的色谱柱与流动相，从而使筛选过程更具针对性，提高首次即获得理想条件的可能性。色谱建模则支持多变量同步优化，从而显著减少所需实验次数。接下来，我们将具体探讨这些工具的实际应用方式。

在HPLC方法开发中，常用的两种理化性质预测参数为log D与pKa。

如上图所示，log D是随pH变化的疏水性度量，其数值由图中公式计算得出。其本质是描述化合物在辛醇与水两相间的分配行为。因此，较高的log D值代表较强的疏水性。

在反相色谱中，保留行为主要受分析物与疏水性固定相之间的疏水相互作用驱动。因此，若希望在反相色谱中获得良好的保留，通常需使化合物具有较高的log D值。这使得log D成为选择合适色谱技术的有力工具，并可避免对可能无法实现预期保留的固定相进行无效筛选。

例如，若某化合物的log D曲线在所有pH条件下均处于较低水平（如上图左下所示），则表明其在反相色谱中保留较弱。此时可考虑采用更适用于极性化合物的替代技术，例如亲水相互作用色谱。此外，log D曲线也可用于确定可最大化疏水性的流动相pH范围。

pKa值同样可为流动相pH的选择提供依据。为最大化疏水相互作用，通常希望化合物处于中性形态。pKa可用于指示化合物主要以中性形式存在的pH区间。

以抗坏血酸为例，其pKa为4.2。在pH 4.2时，该化合物以50%的中性形态与50%的去质子化离子形态共存。经验上，当体系pH与化合物pKa相差2个单位时，化合物几乎完全以中性形态或离子形态存在，具体取决于pH方向。因此，在pH≤2.2的条件下，抗坏血酸几乎完全以中性形态存在。若采用反相色谱分析该物质，则应选择pH低于2.2的流动相，以实现最佳保留。

不幸的是，情况并非总能像前述简单案例那样直接。当化合物含有多个可电离基团时，往往难以找到使其完全呈中性形态的pH值。

例如，阿莫西林同时具备酸性与碱性官能团，导致其在全pH范围内均无法以中性状态存在。但即便如此，pKa预测仍具有重要价值。若分子在反相色谱分析过程中以多种质子化状态共存，可能导致峰形对称性不佳。通过pKa预测，可选择使化合物主要以单一质子化形态存在的pH值，从而避免上述问题。以阿莫西林为例，pH 5至6的区间较为适宜，此时该化合物处于第二种质子化状态——即酸基去质子化、碱基质子化的形式。

此外，理化性质预测也有助于在方法开发初期构建稳健性。通过选用化合物电离状态对pH微小波动不敏感的区域，可减少因pH变动引起的色谱行为变化，从而提高方法的可重复性与耐用性。

接下来介绍色谱建模。首先需确定待优化的参数，随后通过一系列初始建模实验，对这些参数进行系统性调整。例如，若要建立温度与梯度模型，则需在不同温度下分别运行多种梯度条件进行实验。

基于这些实验结果，收集保留时间、峰宽、峰容量等保留数据，并将其输入建模软件。软件将这些数据拟合至保留模型方程以计算相应常数。随后，利用所拟合的模型，软件可模拟不同方法条件下的色谱行为，例如展示不同温度与梯度组合下的色谱图。

实质上，初始建模实验相当于训练数据，其所需数量取决于所采用保留模型方程的线性程度。若为线性模型，仅需两个数据点；若为非线性模型，则至少需要三个数据点。

在Pharmaron，我们启动HPLC方法开发时，首先使用ACD/Percepta预测log D与pKa。基于这些信息，我们进行定向筛选，组合测试两种酸性流动相、两种有机流动相以及六种色谱柱。色谱柱选自预设的专用集合，例如针对极性分析物或异构体分离的柱集合。此外，我们还设有一个“最大正交性”集合，适用于对化合物行为尚不明确的情况，该集合包含苯基柱、极性修饰柱、C-18柱等多种类型。另备有可在极端pH条件下操作的色谱柱筛选集，适用于需要此类pH值的分析。

为选择适用的色谱柱筛选集，我们遵循一套结构化流程图，该图根据流动相选择及关键分析物属性（如立体异构性或极性）提供指导。随后，依据分离度、拖尾因子和容量因子等目标标准，筛选出最佳的色谱柱与流动相组合。符合标准的组合则被视为“命中” 。

在选定初始条件后，若分离效果仍需优化，我们会在ACD/LC Simulator中进行色谱建模。通常我们主要优化温度与梯度，有时也会包括pH优化。在软件中生成一种或多种适用方法后，我们会通过实验进行验证，以确保其在实际应用中表现可靠。

在进行pH、梯度和温度的三维优化时，我们通常运行27组实验，即三种pH值、三个温度水平与三种梯度斜率的全因子组合。各参数的取值范围基于文献调研及软件推荐确定。

从建模原理来看，模拟pH对保留行为影响的方程为非线性方程，因此至少需要3个实验点；而温度与梯度对保留的影响通常可视为线性关系，理论上各需2个实验点即可建模。

因此，理论上仅需12组实验（3个pH×2个温度×2个梯度）即可完成三维优化。但为提高模型预测精度与稳健性，实践中我们尽可能对每个参数设置三个水平进行系统优化。

此处通过一个案例研究来具体说明该工作流程的实际应用。

在本方法中，我们关注三种分析物：起始物料、中间体与API。我们首先对它们进行了log D与pKa预测。在pKa预测中，Percepta软件采用了两种不同算法：GALAS与Classic。若两种算法的预测结果差异显著，我们会基于各自结果分别选择流动相pH；本例中两者预测结果较为一致。

Percepta还提供了辅助pH选择的可视化图表，其中log D随pH的变化被绘制成曲线，合适的pH区域以绿色高亮标示。该判断部分基于化合物的主要离子形态：若在某pH下预测存在多种离子形态，则根据各形态所占比例，区域将标记为橙色或红色。在本例中，碱性区域显示为绿色，因为该条件下化合物主要以单一离子形态存在。

然而，结合该区域的log D值及pKa预测进一步分析可知，起始物料与API在此条件下几乎完全处于电离状态。因此，为最大化保留效果，我们最终选择了酸性pH条件，使化合物主要以中性形态存在。

基于上述分析，我们最终选用了两种酸性流动相进行筛选：0.1%磷酸水溶液（pH约2）以及pH 3的甲酸铵水溶液。有机流动相则选用乙腈与甲醇。色谱柱筛选方面，依据流程图建议，选择了最大正交性组合进行测试。

完成筛选后，依据预设的分离目标标准，我们确定了最优条件组合，并决定进一步验证该方案：即采用0.1%磷酸-乙腈作为流动相，搭配ACE Excel C-18色谱柱。

在实际筛选中，常会出现多个符合条件的方案。在满足基本分离标准的前提下，我们还会综合考虑基线噪声水平、流动相配制复杂度等其他因素，以确定最终选用方案。本例中，使用甲酸流动相同样在该色谱柱上获得了良好的分离结果，但考虑到磷酸体系具有更稳定的基线表现，最终选用磷酸-乙腈体系进行后续分析。如上图所示，在该条件下各分析物色谱峰分离良好，符合方法开发要求。

随后我们对粗样品进行了分析，发现其中存在三种新杂质。其中一种杂质与API的洗脱时间极为接近，位于API峰的尾部。尽管计算分离度为2.1，但二者未能实现基线分离，如上图所示。

因此，为改善该分离效果，我们决定采用色谱建模技术对温度和梯度进行优化。共设计并进行了9组实验：在30°C、40°C和50°C三个温度下，分别运行2.5%、5%和7.5% B/分钟三种梯度条件。

然后，我们将9组实验所得的保留数据输入ACD/LC Simulator软件进行建模。软件界面左侧可便捷调整梯度、温度及关键峰对（即洗脱最为接近的两个峰）的最小分离度要求；右侧分别为梯度编辑窗口与分离度图谱。梯度编辑器直观显示梯度曲线并支持手动编辑；分离度图谱以热图形式呈现不同方法条件对关键峰对分离度的影响，其中蓝色表示低分离度，橙色表示高分离度，黑色对角线区域表示未达到预设的适用性标准（本例中为分离度低于1.5）。

该分离度图谱亦可用于评估方法的稳健性，能够直观反映方法条件的微小波动对色谱行为的影响。从Y轴为温度的图谱中可见，较低温度能带来稍高的分离度。综合考虑分离效果、可持续性及色谱柱寿命，我们最终选择在30°C下进行后续分析。

最终优化方法的实验谱图 (黑色) 与模型预测谱图 (红色) 对比显示，预测准确性良好：平均误差为0.8%，绝对误差为0.1分钟。API与杂质的分离度由原来的2.1显著提升至4.5，达到了预期目标。该方法现已通过验证，并被确立为稳定性指示方法。

最后，我将总结采用计算机模拟方法所体现的优势，并提出一些在实际应用中需注意的事项。

随着对可持续发展的要求日益提高，减少HPLC方法开发过程中的溶剂消耗与废液产生已成为重要目标，而计算机模拟工具正是实现该目标的有效途径。这些工具不仅有助于在方法开发早期构建稳健性，也能在后续阶段显著节省时间。通过建模，研究人员可以做出更明智、更快速的决策。例如，在某一案例中，我们通过ACD/LC Simulator评估不同条件后，发现原有设计空间无法实现目标分离，最终通过更换流动相或色谱柱解决了该问题。若仅依靠手动优化，此类决策往往耗时更长，且会伴随更多的资源消耗。

色谱建模的另一优势在于其可复用性：一旦建立模型，即可随时用于新增化合物的分析或针对不同目的进行方法再开发。此外，该模拟方法简化了方法开发流程，降低了对色谱专家经验的依赖，从而使该方法更易于被掌握和应用。

需注意的是，预测准确性并不完全等同于方法可行性。我们曾遇到平均预测误差超过3.5%的情况，但因分离度仍满足要求，软件推荐的方法依然可用。然而，若杂质峰与主峰洗脱极为接近，即使微小的预测偏差也可能对分离度产生显著影响。因此，所有预测结果均应视为初步参考，必须通过实验验证其在实践中的表现。

可靠的建模依赖于可靠的输入数据。若输入数据不具备代表性（例如使用性能下降的色谱柱所得到的数据），则无法获得可靠的预测结果。此外，计算机模拟工具在峰识别方面尤为有用，特别是在复杂混合物中，其洗脱顺序可能随条件变化而发生显著改变。

感谢各位的聆听！