蛋白稳定性分析仪PSA-16助力生物传感器开发

蛋白稳定性分析仪PSA-16助力齐鲁工业大学（山东省科学院）生物研究所的科研工作者于 2025年4月在《International Journal of Biological Macromolecules》期刊上发表“Structural-guided high stable fusion urate oxidase engineering to self-assemble with cellulose modified electrode for enhanced uric acid sensing”论文。

Xingbao Wang, Weili Gong, Yunlong Xue, Yi Yu, Xiaozhen

蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。

蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在受热时，其结构发生变化，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用熔解温度（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）来表示，即蛋白质解折叠50% 时的温度。

在固定化尿酸氧化酶（UOX）的高稳定性和保留的催化活性是实现尿酸（UA）精确传感器的关键。本研究开发了一种基于自组装固定化UOX的电化学UA生物传感器，通过在纤维素修饰电极上融合碳水化合物结合模块（CBM）来促进UA的检测。借助计算结构导向的酶工程策略，证明了N端CBM3融合的结构稳定性优于C端融合的CBM3或CBM2。进一步删除了预测对CBM3-UOX结构稳定性有害的CBM3 N端残基（P2VSG5）和连接区残基（K158EPMSN163），构建了CBM3-Δ10aa-UOX，与戊二醛交联的UOX生物传感器（0-0.375 mM，5天）相比，显著提高了UA生物传感器的可靠性，在0至0.625 mM UA范围内表现出线性关系，R2 > 0.99，可持续20天。此外，通过野生型UOX和CBM3-Δ10aa-UOX的共固定化（0-0.875 mM，> 34天，R2 > 0.99），探究了融合UOX在初始阶段电流增加的机制，并将其归因于UOX亚基之间的相互作用和连接肽断裂，进一步证明了CBM3-Δ10aa-UOX连接肽的增强稳定性可延长电流增加过程并提高工作寿命。本研究强调了自组装固定化在推进生物传感器领域的有效性，并为类似多聚体生物传感器的进化提供了稳健的策略。

尿酸（UA）是一种在血清和尿液等生物体液中广泛存在的关键含氮化合物，是嘌呤代谢的主要终产物。健康个体血清中UA的正常水平分别为成年男性约0.21-0.43 mM和成年女性约0.15-0.36 mM，而在痛风患者中，UA浓度可高达1.49-4.46 mM。生物体液中UA水平的异常可提示痛风、代谢综合征和肾脏疾病等疾病，使其成为检测嘌呤代谢相关疾病的有用生物标志物。因此，生物体液中UA的快速可靠检测通常对其诊断和治疗至关重要。

目前，已开发出多种UA测定方法，包括高效液相色谱法（HPLC）、分光光度法、离子色谱法、HPLC/同位素稀释质谱法（ID-MS）和电化学生物传感方法。在这些方法中，基于尿酸氧化酶（UOX或尿酸酶，EC 1.7.3.3）氧化还原催化的电流型酶生物传感器因其简单性、灵敏度、特异性和快速响应而受到广泛研究关注。UOX反应方程式如下：UA + 2H2O + O2 → 尿囊素 + H2O2 + CO2。在生物传感过程中，固定在电极上的UOX与UA反应，消耗O2并产生H2O2。减少的O2或氧化的H2O2与UA浓度成正比，氧化或还原信号可通过换能器和电子放大器转换并放大为可读的物理信号。因此，固定化UOX的高稳定性和保持的催化活性是实现UA精确传感的关键。

在先前报道的研究中，已利用不同类型的酶固定化技术构建电流型UA生物传感器。物理吸附和包埋法常用于UOX固定化，但其吸附过程的结合力较弱，易受环境变化影响，从而降低相应生物传感器的操作和储存稳定性。UOX包埋通常使用聚苯胺（PANi）和聚吡咯等聚合物实现。然而，固定化酶从这些聚合物中的泄漏可能影响其稳定性。使用戊二醛或碳二亚胺等双功能试剂在酶与载体或牛血清白蛋白（BSA）之间形成稳定共价键的共价结合和交联方法也是化学固定UOX的常用方法，可避免酶的解吸和泄漏。然而，共价结合法引起的广泛酶失活和低重复性限制了其在生物传感器中的应用。最近，亲和吸附法已被证明是一种有前景的酶固定化策略，可提高酶生物传感器的性能。此外，通过基因工程将来自家族2的碳水化合物结合模块（CBM2）与葡萄糖氧化酶融合，以促进葡萄糖传感性能。然而，UOX的结构和催化机制与葡萄糖氧化酶完全不同，因此探索构建稳定且具有活性的CBM融合UOX作为UA生物传感元件仍然至关重要。

UOX是一种功能性四聚体桶状结构，其活性位点由来自两个单体的界面残基形成。每个单体包含两个具有ββααββ反平行超二级结构的相同结构域，称为隧道折叠结构域。某些弱相互作用（非共价键、次级键），包括范德华力、氢键、盐键（解离键）和疏水相互作用，参与稳定四级结构。此外，亚基之间形成的紧密界面处极性和疏水基团的互补排列促进了特定亚基的关联。在UOX催化过程中，采用无辅因子方式促进和控制O2化学，提出了类似于黄素依赖性氧化酶或黄素依赖性单加氧酶的不同催化机制，但其作用机制尚未完全阐明。由于UOX的多亚基依赖性催化活性和模糊的催化机制，过去几十年中关于性能改进的工程化UOX的研究报道较少。因此，构建稳定的基因融合UOX是一项重大挑战。

串联融合是构建合成融合蛋白的一种流行且可行的策略。使用该策略获得理想的融合蛋白时，应仔细考虑两个不可或缺的要素：融合伙伴之间的最佳结构域放置顺序和选择合适连接子将蛋白质结构域连接在一起。融合蛋白的盲目设计可能导致多种不良后果，包括结构域错误折叠、蛋白质产量低和生物活性降低。由于专门用于蛋白质结构预测和蛋白质合理设计的计算程序（如AlphaFold2、PROCHECK、AutoDock Vina和GROMACS ）的显著发展，可以更好地理解融合蛋白结构并避免许多不良结果。

在本研究中，我们借助结构引导的酶工程策略构建了一系列CBM融合尿酸氧化酶，并探索了影响融合UOX作为生物传感元件稳定性的关键因素，结果表明CBM3 N端连续残基（P2、V3、S4、G5）和158至163位（K158EPMSN163）域间锚定区域对CBM融合UOX结构稳定性的关键作用。删除不稳定残基后，UA生物传感器的可靠性显著提高。本研究有助于合理构建具有可调和可预测特性的融合UOX，并为制造优异的UA生物传感器提供了理想候选者。

为了对所有 UOX 进行更全面的结构表征，我们使用差示扫描荧光法（DSF）[34] 进行了热稳定性测定。如图 S7 所示，UOX-CBM3 和 UOX-CBM2 的峰形更不对称，尤其是 UOX-CBM2，这表明由于 CBM 和 UOX 的断裂，多个结构域协同变性。相比之下，CBM3-Δ10aa-UOX 的差示扫描荧光（DSF）峰最对称且最窄，这证实了其结构稳定性，正如分子动力学（MD）模拟和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析所表明的那样。

使用北京佰司特科技有限责任公司生产的 PSA-16 蛋白稳定性分析仪对目标蛋白的热稳定性进行了评估。首先将样品稀释至 0.5 毫克/毫升的浓度。然后，将 20 微升稀释后的样品置于石英玻璃管（产品编号 LG-002，同样来自北京佰司特科技有限责任公司）中。采用线性温度扫描法，测量 330 nm和 350 nm处的内源性蛋白质荧光强度。温度范围为 23 至 97  ℃，升温速率为每分钟 1 ℃。根据 F350/F330 曲线的斜率计算出热变性中点温度（Tm）。每个样品均重复测量四次。

内源差式扫描荧光inDSF，基于蛋白质中特定氨基酸的荧光特性。这些氨基酸的荧光强度与其所处的微环境密切相关，因此，当蛋白质的结构发生变化时，这些氨基酸的荧光信号也会随之改变。不需要额外的荧光染料加入到检测体系中，利用蛋白内部芳香族氨基酸的自发光原理。不需要任何额外的标记或固定步骤，避免引入结果的不确定性。

研究发现，蛋白质分子中芳香环氨基酸在处于不同极性的微环境时 (如疏水或亲水环境中)，其被激发的内源荧光的最大发射光谱会发生位移。蛋白质中内源荧光主要来自含芳香环氨基酸如色氨酸 (Trp)，苯丙氨酸 (Phe) 和酪氨酸 (Tyr)，其中以色氨酸内源荧光最强。当它在蛋白内部时，发射光主要在330波段，当蛋白一旦去折叠，暴露在溶剂中，发出的光就会从330波长红移到350。所以通过280激发，检测330/350的比值变化，就能测量蛋白质的Tm值。

以色氨酸为例，在蛋白质疏水的内核微环境中，其内源荧光最大发射波长在330 nm左右，而在亲水的极性微环境中，色氨酸的内源荧光最大发射波长则出现在350 nm左右。蛋白质热变性或者化学变性通常会导致色氨酸残基周围微环境的极性发生变化，使通常被包埋于蛋白质疏水内核的色氨酸逐渐暴露于亲水的环境中，从而导致发射内源荧光最大发射波长发生红移(Red Shift)，即向更大的波长区域 移动。

特点：内源差式扫描荧光DSF无需复杂的样品处理或标记步骤，实验相对简便。但不是所有蛋白质都含有足够的荧光基团，且可能会受其他基团影响。

北京佰司特科技有限责任公司于2023年推出了自主研发的第一款国产的蛋白稳定性分析仪PSA-16。

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