慢病毒操作之—细胞永生化

2021-02-22 11:21:55, 搬砖小陈上海吉凯基因医学科技股份有限公司

前言

在1900年代初期，细胞培养开始被科学家广泛使用，他们从组织中分离细胞并在体外培养。但是，正常细胞在培养中不会无限期地生长，因此科学家持续从原始组织中重新取样，但这既费时又费力。1941年，产生了第一个连续分裂的啮齿动物细胞系，十年后，又开发了第一个人类癌细胞系，即著名的HeLa细胞，最早的应用是开发脊髓灰质炎疫苗，随后，应用于全球范围的科学研究中，如细胞克隆的发展以及发现人类细胞的23条染色体。

HeLa细胞是最早被广泛应用的永生化细胞，那么什么是永生化细胞呢？

Hela细胞

永生化细胞的定义及研究意义

正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这种现象称之为海弗利克极限。细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离, 从而具有无限增殖能力的过程称为细胞永生化(cell immortalization) 。与正常细胞相比，永生化细胞具有以下科研价值：

永生化细胞稳定均一、性状一致，是体外研究细胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型；
可使传代困难、增殖慢、易衰老的细胞获得永生，并且永生化细胞比原代细胞更易于培养，因为它们生长更强劲，可以获得更多的细胞资源，也节省了分离细胞的周期，降低反复分离原代细胞的成本；
永生化细胞和肿瘤细胞关系密切，是研究肿瘤发生机制的重要模型；
永生化细胞可建立稳定细胞库，遗传上相同的种群，有助于提供一致且可重复的实验结果。

常用的永生化细胞系，来自《神经科学研究技术指南》

生产永生细胞系的方法

细胞永生化过程中，常规的分子机制为两种，一种是抑癌基因如p53, pRb, BRCA1, DPC4等受到外源病毒蛋白抑制或者自身突变而失去活性，改变细胞的终末分化，诱导细胞进入S期，使细胞绕过正常细胞的周期检查点，细胞老化途径受阻（如毒癌基因、人乳头瘤病毒E6、E7，均可抑制p53功能）；另一种是激活端粒酶延长端粒长度，从而使细胞获得持续增殖的能力，此外，一些原癌基因如myc也可有效诱导原代细胞永生。

目前有多种细胞永生化的方法，但不是每一种方法都可使一个特定的细胞永生化。由于细胞的来源动物、组织不同，其细胞的增殖、分化调控也不尽相同，因此，每类细胞的永生化的分子机制不同，其永生化细胞的方法也不同，如HPV可介导人的包皮细胞、角化上皮以及乳腺、胰导管和口腔等的上皮细胞永生化、猿猴病毒的SV40 大T抗原（TAg）用于黏附细胞、成纤维细胞、内皮细胞等、EBV用于淋巴母细胞样细胞、端粒酶TERT则用于间充质干细胞和其他一些细胞。目前，较为常用以及便利性的是TERT和TAg，并且该方法操作的细胞并未出现肿瘤细胞的转化特征，也就是细胞类型未发生变化^1，4 ：

端粒酶是一种能延长端粒末端的核糖核蛋白酶，其以自身的RNA为模板，从端粒DNA3’-OH 末端延伸端粒或合成新的端粒DNA，以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短，从而维持端粒的长度，使细胞不会因端粒耗尽而出现凋亡。正常情况下，大多数体细胞端粒酶的表达是严格调控的，表达是瞬时和低水平的。在原代培养的细胞中稳定表达人端粒酶催化亚基(hTERT)基因能稳定端粒的长度，使细胞易于永生化，因此hTERT的激活是细胞永生化的重要步骤。
SV40大T抗原（TAg）通过与肿瘤抑制因子Rb和p53结合并抑制其功能而起作用。与大多数其他致癌基因产品不同，由于其对细胞周期的多种作用，单独的TAg可以在不存在其他致癌蛋白的情况下使细胞永生³。

TAg介导的永生化hLSEC品系的形态和表型分析，（A）WB检测TAg表达，（B）显微镜观察细胞形态，（C）染色分析，（D）hLSEC吸收乙酰化的低密度脂蛋白分析¹

借助TERT或者TAg依靠慢病毒或者逆转录病毒稳定表达于目的细胞即可实现大部分细胞的永生化（注意：永生化细胞需要TERT或者TAg的持续表达才可维持永生化特征，非整合型介导手段如质粒、腺病毒、AAV等无法实现细胞永生化）：

FACS分析去除TAg（+CRE）、保留TAg（-CRE）的细胞增殖情况，说明hLSEC系严格依赖于永生化基因的存在以进行细胞分裂

当TERT或者TAg引入细胞后，借助病毒载体携带的荧光或者抗性基因筛选出阳性细胞，随后观察细胞形态以及增殖情况。永生化成功的标志是：细胞类型未发生转化（通过观察分析）、细胞可以持续稳定地分裂（与原代细胞进行同步传代验证分析，如文章的hLSEC未转hTERT的细胞在第12代附近停止分裂并在不久后死亡，而转入hTERT的细胞传100余代依然可继续传代，说明永生化成功¹）。

永生细胞系的局限性

使用永生化细胞的主要缺点是不能将这些细胞视为“正常”细胞，因为它们会无限分裂，有时会表达在体内任何细胞类型中都找不到的独特基因模式。因此，它们可能不具有相对正常细胞的相关属性或功能。同样，在连续生长一段时间后，细胞特性可能会发生变化，甚至与“正常”细胞的特性变得更加不同，如永生化大鼠肝细胞与其原代细胞的比较表明，细胞中氧化酶活性升高⁵。因此，某些实验使用原代细胞是有利的，并且，建议定期验证培养细胞的特征，而不要使用已经传代过多的细胞。

结语

无论如何，永生化细胞在生物发育机制、疾病模型、基因治疗等多方面具有极大价值，如神经母细胞瘤细胞系Neuro2A用于电生理和发育研究、肾上腺肿瘤PC12细胞用于研究与神经元分化机制、COS-1细胞系生成促红细胞生成素用于治疗贫血、杂交瘤细胞生产单抗等，并且得益于永生化技术，性状一致性的细胞可以大批量生产，从而有了ATCC、ECACC、DSMZ这样规模化细胞存储库，从而更好地助力科研。

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4. Telomerase expression in human somatic cells does not induce changes associated with a transformed phenotype.

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