客户成就 | 透明化大组织的高效3D成像

2020年3月蔡司发布了全新的激光片层扫描成像系统 Lightsheet 7（点击查看），之后的大半年里，我们和国内多位组织透明化成像和研究相关领域的专家一起进行了大量的样品测试。谨通过此文，与大家分享其中一些透明化大尺寸样品成像的精彩案例。

第一个鼠脑，由清华大学生物医学测试中心的张丹老师提供，经典的透明化方法CLARITY（RI 1.46），代表性的Thy-1 GFP 神经标记。蔡司 Lightsheet 7 仅仅用了不到半小时就完成了这样一个超过厘米尺寸的样品的全貌成像（成像之后是大约1h的数据处理），同时也有极佳的图像质量和分辨率。

第二个鼠脑，来自交通大学生物医学工程学院的李小卫老师。采用 CUBIC（RI 1.54）透明化，红色信号标记全脑的血管图谱。经实测溶液折射率高达1.54，利用可调焦物镜，可以将物镜与溶液折射率匹配，得到最佳光切成像效果。利用z-stack + Tiles成像，从样品装载到最终视频结果的获取，半个工作日轻松搞定。

▲CUBIC 透明化的小鼠全脑血管图谱

成像尺寸：14.34 x 18.00 x 9.817 mm³

成像物镜：5x / 0.16 foc.

在以往的透明化小鼠全脑成像中，受限于传统物镜的工作距离，老师们不得不采用将鼠脑的背侧和腹侧分开拍摄，再进行数据拼接的方式，整个拍摄过程以及后续的数据整合非常复杂繁琐且易出错，即使是专业的老师，也至少需要3天的时间才能得到最终的视频结果。而现在蔡司为光片成像专门研发了这颗大样品成像物镜，大尺寸物镜前端镜同时保证了足够的数值孔径以及10.5mm的工作距离，让大尺寸鼠脑成像和共聚焦上的z-stack + tiles 同样简单。

▲超长工作距离物镜让鼠脑成像也可以“一镜到底”

第三个是基于有机溶剂方法PEGASOS 制备透明化鼠脑（RI 1.54），同样也是Thy-1 GFP，中国科学院上海营养与健康研究所的陈瑜洁老师和我们一起进行了测试。使用5x物镜即使是远离物镜的一侧信号也十分清晰，而大约480GB的数据只用蔡司ZEN 软件就可以轻松地完成拼接和3D展示，不用再进行繁琐的数据格式转换。此外我们还尝试了有机溶液专用的20x物镜（折射率匹配1.48~1.58）进行了局部深度拍摄。

▲5x / 0.16 foc. 物镜拍摄的PEGASOS 透明化Thy-1 GFP小鼠全脑

▲20x / 1.0，nd1.53 物镜拍摄的其中单个视野信号

仁济医院的高坡老师在蔡司最新光片成像系统上尝试了一组PEGASOS（RI 1.54）制备透明化样品：小鼠的整个神经系统（鼠脑+脊髓）。“巨大”且不规则形状的样品“恰好”和蔡司Lightsheet 7非常匹配：

✓ 悬挂上样方式不用担心样品被挤压，也比直接在底座放置更容易成像。

✓ 足够大的样品室不仅可以装下也可以轻松完成它的整体成像。

✓ 不规则的形状让操作人员很难判断到底需要多大的拼图范围，但Lightsheet 7特色的LED透射光可以轻松帮我们确定样品边界，之后自动完成拼图模块中参数的设定。

▲形状不规则的小鼠神经系统（鼠脑+脊髓）

▲PEGASOS 透明化的小鼠神经系统（鼠脑+脊髓）

成像尺寸：12.96 x 27.25 x 7.164 mm³

成像物镜：5x / 0.16 foc.

▲Lightsheet 7 悬挂式上样方式更加开放，兼容各种不同大小形状样品

▲Lightsheet 7 LED透射光实现快速样品定位，确定成像边界，自动形成拼接参数

广东省医学科学研究院，广东省人民医院费继锋老师为我们提供的三色蝾螈胚胎，用 2ECI 进行透明化（RI 1.56）。得益于在光片显微镜透明化成像中蔡司特有的双色荧光同时成像（双相机配置可选），以及包括蓝色荧光在内的色差校正（400nm~770nm），我们快速得到了这个没有拼图痕迹的高质量多色图像，原始数据量达到了惊人的1.9 TB。

▲2ECI 透明化的蝾螈幼虫

成像尺寸：6.65 x 19.50 x 4.741 mm³

红色：鳍、脊髓、骨及肌肉组织

绿色：全身表达

蓝色：DAPI 标记细胞核

成像物镜: 5x / 0.16 foc.

第四个案例，来自郑州大学附属医院郭光禹老师为我们提供的一个iDISCO（RI 1.56）处理的小鼠劲动脉。绿色是大鼠颈动脉，红色是内皮细胞以及血管壁自发荧光。在这个案例中，老师想要看清楚血管腔内侧内皮细胞（红色）的定位，对分辨率有价高的要求，于是我们采用了蔡司关联解决方案：

✓ 5x 物镜快速（大约1 min）获取样品全貌（红绿双色同时成像）。

✓ 20x / 1.0 物镜对感兴趣区域进行高分辨率成像，清楚的看到单个内皮细胞（红色）在血管腔内的定位。

✓ 蔡司特有 ZEN Connect 和3D Connect模块实现不同物镜拍摄的两个 3D 图像在二维平面和三维空间的关联定位。

通过这种关联方法，既可以快速得到样品全貌，又可以将感兴趣区域的高分辨图像与之定位，可以非常高效地帮助老师得到更多的实验信息。

后续我们也可以通过光片的3D全貌定位，精准地切割出感兴趣区域进行共聚焦或超高成像，类似蔡司X射线显微镜（点击查看）和3D电镜的关联。

▲5x物镜的小鼠颈动脉全貌（大图，绿色）与20x物镜拍摄的血管内皮细胞（小图，红色）在平面上的关联

▲5x物镜的小鼠颈动脉全貌（绿色）与20x物镜拍摄的血管内皮细胞（红色）在空间上的关联

以上这些案例中的透明化样品中既有基于水溶液的透明化方法CLARITY、CUBIC，也有基于有机溶剂的PEGASOS、iDISCO和2ECI，蔡司Lightsheet 7都能获得优异的图像质量。因为在这台显微镜中，最闪亮的就是蔡司为透明化成像专门研发的可调焦物镜（包括照明和成像物镜）。可调焦物镜可以保证在应对不同折射率的透明化样品时，激发光片始终处于最佳的薄且平整的状态，这样才能把光片成像极具优势的Z轴分辨率表现出来。而可调焦的成像物镜（匹配折射率1.33~1.58全范围覆盖），保证了光片激发出的荧光信号始终处于物镜的焦平面，基于水溶剂和有机溶剂的透明化方法都能轻松hold住。

▲光片显微镜透明化成像专用照明物镜，适用于不同放大倍数的成像物镜，匹配样品折射率1.33~1.58

▲光片显微镜透明化成像专用成像物镜，匹配样品折射率1.33~1.58

不论是现在还是将来，蔡司期待和中国的科研工作者一起，在透明化成像领域做出更多出色的工作。