揭秘蛋白质翻译后修饰（PTM）间的“秘密对话”

Mario Leutert等人在Molecular & Cellular Proteomics上发表的综述Decoding Post-Translational Modification Crosstalk With Proteomics^[1]，系统探讨了PTM串扰的基本概念、研究方法及其功能意义，并展望了未来的研究方向。

PTMs是指蛋白质在翻译过程中或翻译后，通过共价修饰在特定氨基酸位点上添加化学基团。在真核细胞中，目前已知的PTMs种类超过300种，涉及15种蛋白质氨基酸的侧链及主链，其中最常见的有磷酸化（Phosphorylation）、糖基化（Glycosylation）、泛素化（Ubiquitination）、乙酰化（Acetylation）和甲基化（Methylation）。

这些修饰通常是可逆的、动态的，能够显著改变蛋白质的功能。例如，磷酸化驱动信号转导通路，糖基化调节膜蛋白和分泌蛋白的稳定性，泛素化标记蛋白质用于降解，几种赖氨酸的修饰包括乙酰化和琥珀酰化则对代谢状态敏感并能调节翻译过程，而组蛋白的N端末尾则有多种修饰则调控染色质状态和基因表达。

PTM机制由“写入者”（writers）、“擦除者”（erasers）和“读取者”（readers）组成（图1A）。写入者，例如激酶、泛素连接酶和乙酰转移酶，通过酶促反应催化修饰基团转移到蛋白质底物上。这些修饰基团通常以单一实体的形式转移到蛋白质上，但在某些情况下，也可以以线性或分支聚合物的形式被写。相反，擦除者，例如磷酸酶、去泛素化酶和去乙酰化酶，通过催化从蛋白质底物上移除这些修饰，赋予其可逆性。PTM的读取者包括一类具有高亲和力的蛋白质结构域，这些结构域针对具有特定PTMs的蛋白质，通常是传递PTM依赖功能的蛋白质。

PTM串扰则是指一个PTM直接影响另一个PTM的添加、去除或功能。这种影响可以发生在同一个蛋白质上（intra-protein PTM crosstalk），也可以发生在不同蛋白质之间（inter-protein PTM crosstalk）。根据Hunter的分类，PTM串扰可以分为“正向”（positive）和“负向”（negative）两种类型：

• 正向串扰：一个PTM触发或促进另一个PTM的发生。

• 负向串扰：一个PTM阻止或抑制另一个PTM的调控。

在同一个蛋白质上发生的PTM串扰通常表现为相邻氨基酸残基上的修饰相互影响。这种串扰可以通过以下几种方式实现：

• 邻近位点相互作用：例如，经典的例子包括调控染色质状态的组蛋白H3 N端修饰、调控基因表达的RNA聚合酶II C端重复序列的多位点磷酸化、GSK3的连续磷酸化，以及PEST序列处的“磷酸降解信号”（phosphodegrons），其中磷酸化促进邻近赖氨酸残基的泛素化，并随后通过泛素-蛋白酶体系统降解。

• 同一残基竞争：如雌激素受体β的Ser16位点上，O-GlcNAcylation和磷酸化相互竞争，前者可能保护蛋白质免于磷酸化介导的降解。

• 远距离作用：虽然在序列上相距较远，但通过结构上的邻近性或变构效应实现串扰。

不同蛋白质之间的PTM串扰通常涉及一个蛋白质上的PTM影响另一个蛋白质上的PTM。例如：

• 激酶活化：蛋白激酶通常需要其激活环的磷酸化才能发挥作用，进而影响下游底物的磷酸化。

• 酶活性调控：某些E3连接酶的磷酸化可以增强或阻断其对目标蛋白的泛素化。

• 结合表面调节：如有丝分裂期间着丝点的形成，需要通过inter-protein PTM串扰协调动态的蛋白质相互作用界面。

PTM串扰的这些机制使得细胞能够快速实现复杂的信号处理，如开关和识别基序，充当信号网络中的逻辑门。

传统上，PTM串扰的研究依赖于针对性的生化实验，如体外酶促反应、遗传或化学扰动等。然而，随着质谱技术的发展，蛋白质组学已成为研究PTM串扰的强大工具，能够在全蛋白质组水平上识别和量化PTMs。以下是当前主要的蛋白质组学方法：

最简单的方法是通过并行或顺序富集不同PTMs的肽段，分析其共存情况。例如，Hendriks等人通过富集SUMO修饰肽段，识别出同时含有磷酸化、泛素化、乙酰化等多种修饰的肽段，揭示了SUMO化与磷酸化之间的广泛串扰。

有方法可以分离出含有两种不同PTMs的肽段。例如，强阳离子交换色谱与di-glycyl抗体富集相结合，分离出同时含有泛素化和磷酸化的肽段，识别出437个共修饰肽段。此外，对于序列上相距较远的PTMs，可先在蛋白质水平富集一种PTM，再在肽段水平富集另一种PTM。

在质谱数据分析中，PTMs被定义为可变修饰，数据库搜索需考虑所有可能的修饰形式。由于多修饰肽段的假阳性率（FDR）计算具有挑战性，需采用专门策略（如分别估算修饰肽段的FDR）以确保准确性。针对组蛋白等多修饰情况，还开发了专用软件来区分和量化不同修饰形式的肽段。

开放式修饰搜索允许在质谱数据中识别未知或意外的修饰。通过允许较大的质量差异（如±500 Da），研究人员可以发现新的PTMs或修饰组合。例如，Chick等人通过开放式搜索，在HEK293细胞的蛋白质组数据中识别出46%的新修饰，其中20%为生物学相关的修饰，包括多种磷酸化和糖基化修饰。

Middle-Down蛋白质组学分析较长的肽段（25-100个氨基酸），增加了检测同一肽段上多个PTMs的机会，适用于研究中等距离的intra-protein PTM串扰。该技术广泛用于研究组蛋白上的PTM串扰，以及泛素链的拓扑和分支。

Top-Down蛋白质组学直接分析整个蛋白质，能够揭示proteoform水平上的PTM组合。例如，通过自上而下蛋白质组学技术，研究人员揭示了心脏肌钙蛋白上的磷酸化位点组合和顺序。原位Top-Down蛋白质组学更进一步，保留非共价相互作用，分析蛋白质复合物中的PTMs，从而研究inter-protein PTM串扰。

除了识别共存的PTMs，功能性研究是揭示PTM串扰的关键。以下是几种高通量方法：

通过体外酶促反应，研究一个PTM对另一个PTM附着的影响。例如，Leney等人通过富集磷酸化肽段，体外孵育O-GlcNAc转移酶，揭示了磷酸化对O-GlcNAcylation的抑制作用。

使用合成肽段或肽段文库，结合定量亲和纯化质谱，识别特异性识别PTM组合的reader蛋白。例如，Garske等人使用PTM随机化的组蛋白H3 N端肽段文库，识别了识别特定PTM组合的reader。

通过遗传或化学扰动PTM的writer或eraser，研究对其它PTMs的影响。例如，通过过表达O-GlcNAc转移酶或抑制O-GlcNac水解酶，提高O-GlcNAcylation水平，观察对磷酸化的影响，揭示了两者之间的相互串扰。

通过分析PTM位点的保守性和结构信息，预测PTM串扰。例如，研究发现PTM位点在序列和空间上的共进化，特别是在蛋白质结构域的热点区域，提示了功能上的关联。

随着PTM数据的积累，多个数据库和工具被开发用于整合和分析PTM串扰：

• PTMcode：整合了19个真核生物的30万实验验证的PTMs，预测了基于进化和结构数据的PTM串扰。

• PTM-X：基于文献数据训练，预测intra-和inter-protein PTM串扰。

• DbPTM：整合多个数据库，提供PTM位点和邻近PTMs的信息。

• CrosstalkDB：专注于组蛋白的middle-down实验数据，展示PTM的动态和相互作用。

尽管蛋白质组学技术在PTM串扰研究中取得了显著进展，但仍面临诸多挑战与机遇。未来的研究方向包括：

• 多扰动实验的定量蛋白质组学：通过增加实验复杂性，分析多个生物学条件或扰动下的PTM丰度，揭示intra-protein PTM串扰。

• 蛋白质复合物分析：通过亲和纯化、BioID、交联或尺寸排阻色谱结合质谱，系统分析蛋白质复合物中的PTM状态，揭示inter-和intra-protein PTM串扰。

总之，蛋白质组学技术为研究PTM串扰提供了前所未有的机会。随着技术的进步和方法的创新，我们将能够更深入地理解PTM串扰在生物学过程中的作用，揭示蛋白质调控的复杂网络。这一领域的突破不仅将深化我们对生命科学的认识，也可能为疾病诊断和治疗提供新的策略与思路。

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参考文献

[1] Leutert, M., Entwisle, S. W. & Villén, J. Decoding Post-Translational Modification Crosstalk With Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics 20, doi:10.1016/j.mcpro.2021.100129 (2021).

供稿：生信研发部-王虎强

编辑：市场部