2024-03-13 13:25:32, 华质君 华质泰科生物技术(北京)有限公司
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01/ TriVersa NanoMate 多通道纳喷源 Q&A 第1期
02/ LESA/TVNM 芯片多通道纳喷源 Q&A 第2期
1、 TriVersa NanoMate 如何实现肽段的表征?
TriVersa NanoMate(TVNM/LESA 多通道纳喷源)可进行纳升电喷雾电离,比传统纳喷高出数倍的电场强度使被分析物的离子化效果明显提升;同时 TVNM 更耐盐,能大大降低离子竞争和抑制。
蛋白酶解(可自动化原位酶解或使用传统酶解方法)后的肽段,无论是经由 nanoLC 分离后进入 TVNM 离子源实现纳升液相质谱联用(即,nanoLC-TVNM-MS 模式)、亦或直接以鸟枪法注射同时利用 TVNM 的离子化进入质谱仪(即,DIMS 模式),经 MS 测定精确分子量,MS/MS 进行二级碎裂后,得到母离子及碎片子离子峰,进而实现对多肽及其结构(如氧化、甲基化等翻译后修饰)的鉴定表征。
2、 TVNM 样品盘和芯片的型号有哪些,对样品量有何要求?
TVNM 自带含400个喷嘴的芯片,兼容96或384孔样品盘,能够实现大量样品的自动化检测。芯片有三种规格,分别为2.5 μm、4 μm 和5.5 μm。
推荐进样体积2 μL-5 μL,即使样品量很少也不影响检测。
3、 TVNM 检测分子互作时需要前处理吗,比如纯化?
若是经表达(如大肠杆菌)提取出的蛋白,需进行蛋白的纯化(如使用镍柱等亲和层析柱),浓缩后贮存于-80℃ 下。
但也有文献表明在检测蛋白非共价键相互作用时,即使有少量干扰物的存在(如其它蛋白、蛋白混合物、细菌细胞裂解液等)也可以检测到蛋白-配体复合物。
4、 TVNM 基于什么原理能检测到这么大的分子量?
TVNM 基于纳升电喷雾(nanoESI)原理,形成纳米级尺度的喷雾,灵敏度比传统 ESI 喷雾高出1-3个数量级。
同时 TVNM 通过自回路电场和硅基喷雾芯片的设计,利用喷嘴处的强电场,可以对 μL 级样品实现高效的电离,并产生稳定持久的喷雾,显著提升离子化效率。
尤其对高水含量和含缓冲液 Buffer 的抗体药及偶联物 ADCs 等的离子化效率极高,能获取传统 nanoESI 难以生成的质谱信号。
5、 盐的基质抑制如何,TVNM 分析时样品是否需要脱盐处理?
因芯片纳喷(自回路电场)的离子化效率远高于电喷雾,也强于普通的拉制喷嘴,样品中的化合物能更高效地离子化,所以更耐盐,同时也减少了电荷竞争和抑制。
如果样品的含盐量过高(如近500 mM),可以脱盐柱除盐。
6、 TVNM/LESA 对样品前处理有什么要求?没有分离会不会产生污染?
LESA 液滴萃取表面分析作为新型的质谱进样形式,非常适合对复杂样本(尤其是组学样本)进行高通量分析。
除必要的清洁和脱脂外,一般无需复杂前处理,可充分发挥高端质谱仪,尤其是高分辨质谱和串联质谱的强大功能,发掘样品中丰富的信息。
LESA 通过常规的有机溶剂进行萃取,利用溶剂的选择性萃取出不同类型的化合物。此外 TVNM 每测完一个样品后,会自动更换喷嘴,不会产生交叉污染。
当然,若在线 nanoLC-nanoESI-MS 模式是必须的,则此时的 TVNM (宰牛刀)类似于仅仅行使了 nanoESI 源的单一功能;其他功能闲置。
若期待对经过 LESA 萃取后的液滴继续分离,可采用 LESAplus 模式,即,LESA 后加除盐柱和短柱继续分离,再行芯片纳喷电离和质谱检测。
7、TVNM 如何定量,根据什么原理来做定量?
TVNM 仍然遵循基本的定量理论。定量一般分为相对定量和绝对定量,定量方法可分:外标法、内标法和同位素标记内标法。
若使用外标法,需要有标准物质,在被测物浓度范围内建立标准曲线,并进行定量方法学验证,最后代入被测物质的信号强度测定其含量。
若使用内标法(相对定量),可以使用与待测物质性质相近的另一类物质(离子化效果相似,最好是同系物),或同位素标记内标(绝对定量)进行被测物的定量。
8、TVNM/LESA 若不联接 LC,现有的质谱工作站还可以使用吗?
TVNM/LESA 仍需要现有的质谱工作站。它可以与主流质谱厂商,如 Thermo、Agilent、SCIEX、Waters 等不同型号的质谱进行联接,质谱的控制与数据采集仍通过质谱工作站进行,TVNM/LESA 操控通过 Advion 自研的 ChipSoft 软件进行。
9、LESA 萃取使用的是什么溶剂?检测不同的化合物该如何选择?
针对不同类型的化合物,萃取溶剂也不同。萃取用的溶剂大多为两种或三种不同的有机相按一定比例配制:
如对蛋白,一般采用乙腈-水(50-50,含 1% 甲酸)的组合;
对脂质,一般采用氯仿、甲醇和异丙醇的组合;
对药物等小分子,则采用甲醇/乙腈-水(60-40,含 0.1% FA 甲酸)的组合。
具体的比例可自行优化或参考已发表的文献。
10、TVNM/LESA 在生物医药方面酶切后的蛋白覆盖度?
对单个蛋白,如作为蛋白质评估标准的牛血清白蛋白 BSA,经 TVNM-/LESA 连接 Thermo 高分辨质谱检测,酶切后氨基酸序列覆盖度最高可达95.4%。
采用相同的方法酶切 NISTmAb IgG1 和 MOPC 21 IgG1,其重链氨基酸序列覆盖度可达95.1%、90.5%,轻链为98.6%、99.1%。
详见 DOI: 10.1080/19420862.2019.1599633
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