利用AP-SMALDI MSI揭示经木聚糖酶处理后的玉米种子中不同区域寡糖的变化情况

图2 两个玉米粒经木聚糖酶处理后，仅由戊糖或己糖组成的低聚糖的累积强度的质谱图像，以TIC的百分比表示。

GH5_21和GH5_34处理后，含有己糖醛酸的寡糖位于2号玉米种子的角质胚乳中和1号玉米种子的大部分胚乳中。当用GH30_8处理时，己糖酸在1号玉米种子中明显可见，主要位于种子左下的角质胚乳中的一小部分区域。（图3）

图3 左边是1号玉米种子和2号玉米种子的照片。右边红色部分为Pen4FA（m/z 745.2162），蓝色部分为Pen4HexA（m/z 745.2009），绿色部分为己糖胺（m/z 524.2062）的质谱图像。

如图4所示，单一阿魏酸取代基修饰的低聚糖一般在胚芽附近的胚乳中聚集，在内果皮内和糊粉层内也有少量分布。相反，由两个阿魏酸单位修饰的低聚糖或由脱羧的8-5′-脱氢阿魏酸修饰的低聚糖则分布在整个胚乳中。

图4 左图为低聚糖PenxFA2和PenxFA1Hex1在玉米种子中的质谱图像，右图为Penx-8-5′-DFAdc和PenxFA1在玉米种子中的质谱图像，强度显示为TIC的百分比。

含有乙酰基的低聚糖主要在玉米种子的胚芽、糊粉层和种皮边缘分布较多，在胚乳内分布较少；而未乙酰化的低聚糖则主要分布在玉米种子的核部分。但PenxAc1HexA1类寡糖是个例外，PenxAc1HexA1是最丰富的寡糖种类，在很多方面都不同于其它乙酰化的寡糖，其在整个玉米种子内都有分布。（图5）

图5 左图为乙酰基修饰的低聚糖在玉米种子中的质谱图像，右图为没有乙酰基修饰的低聚糖在玉米种子中的质谱图像，强度显示为TIC的百分比。

通过对质谱图像的观察以及对玉米种子不同区域提取的离子信号平均强度进行对比，对经过酶处理后玉米种子中的低聚糖谱进行比较，发现从胚乳向外，寡糖强度逐渐下降。在不同玉米切片中，寡糖的强度不同，但经同种酶处理后的低聚糖图谱总体趋势相似。

图6 顶部：1号玉米种子（左）和2号玉米种子（右）的照片，并绘制了数据提取区域。蓝色区域代表胚芽附近的胚乳。灰色区域代表远离胚芽的胚乳（仅存在于1号玉米种子的冷冻切片中）。红色区域代表靠近胚芽的胚乳。绿色区域代表远离胚芽的胚乳。底部：如表S1中所述的低聚糖的所有平均离子强度的累积总和，即TIC的百分比。

GH5_21和GH5_34给出了非常相似的寡糖谱，表明在用这些木聚糖酶处理后可检测到相同的寡糖。然而用GH5_34处理的样品的低聚糖丰度明显较高，并且受所分析样品来源的位置的影响较小，详情见图6。另一个有趣的趋势是，低聚糖在玉米种子上的分布随低聚糖的长度而变化，最长的低聚糖通常位于胚芽附近，而短的低聚糖则主要在胚乳中分布，详情见图7。

图7 Pen_2-13在1号玉米种子（上）和2号玉米种子（下）中的分布，左列为经GH5_21处理后，右列为经GH5_34处理后，强度显示为TIC的百分比。

总的来说，GH30产生的寡糖少于GH5_21和GH5_34。如图8所示，GH30发生了变化，而GH5没有变化，表明除了种子内不同区域的寡糖分布变化外，种子之间也发生了变化。种子间阿拉伯木聚糖醛酸修饰的差异可能与GH30是一种葡萄糖醛酸木聚糖特异性木聚糖酶有关。此外，与GH5_21和GH5_34相比，1号玉米种子中GH30分解得到的寡糖更长，低聚糖的修饰种类也更多。

图8 1号玉米种子和2号玉米种子经GH5_21、GH5_34和GH30处理后的修饰较少的低聚糖分布（左列）和修饰较多的低聚糖分布（右列）。

本研究开发了一种新的基于AP-SMALDI的MSI方法来分析玉米种子中木聚糖酶降解阿拉伯木聚糖后形成的低聚糖，提供了降解产物的化学信息和空间信息。研究结果显示了几种带侧链的寡糖的分布，增加了对玉米种子中不同区域多糖成分的了解。

该方法还为玉米种子中不同区域底物的酶活性提供了新的见解，表明阿拉伯木聚糖的结构和组成因种子中的位置而不同。这一发现对于确定靶向降解玉米中保留淀粉颗粒的阿拉伯木聚糖结构的合适酶具有重要意义。