高分辨率AP-SMALDI质谱成像可视化呈现肝片吸虫体内药物摄取和空间分布

实验流程如图1所示。首先对肝片吸虫进行体外药物暴露，接下来将肝片吸虫包埋在明胶溶液中，随后将样品置于冷冻切片机中横向切片，切片厚度为20微米。在氮气气流辅助下，向切片表面喷涂基质，之后对切片进行AP-SMALDI质谱成像分析，随后在Mirion软件中对数据进行可视化处理，获得选定m/z的分布图像。

最后，对成像完毕的组织切片进行H&E染色，进而用光学显微镜采集组织切片的光学图像。虫体中部的横切面主要覆盖以下组织和器官：皮层（包含下层的身体肌肉组织和合胞体）、薄壁组织、肠及肠表皮、卵黄腺、卵巢和睾丸（图2a、图3a和图4a）。

图1  AP-SMALDI MSI用于肝片吸虫药物成像和脂类分析的工作流程图。

本研究中，作者确定了两个标志信号，分别用于标记：

（1）肠表皮和皮层（文中并称为皮层标志物）

（2）内部组织（主要是薄壁组织，因此被称为薄壁组织标志物）

（3）肠表皮和卵巢组织。

作者进一步通过将MS图像与相应的H&E染色光学图像进行比较确定器官的位置（图2a），结合质谱成像方法，作者在肝片吸虫组织切片识别出六种标志物脂类（图2b和2c），可以清晰定位肝吸虫的特定组织。

图2 肝片吸虫病的脂质标志物。a，肝片吸虫组织切片的H&E染色光学图像（空间分辨率为20微米），包括卵黄腺（V）、肠及肠表皮（i，g）、薄壁组织（p）、睾丸（te）和皮层（tg）。b， a中切片对应的质谱成像m/z 812.6219（红色，HexCer 38:0;O4，[M+Na]⁺），m/z 794.6035（绿色，PC O-36:2，[M+Na]⁺或PE O-39:2，[M+Na]⁺），m/z 810.5985（蓝色，PC 36：1，[M+Na]⁺），分别为皮层、肠表皮和薄壁组织的标记。c，第二组标志物的质谱成像，m/z 828.5961（红色，PI O-33:0，[M+NH4]⁺或HexCer 38:0;O4，[M+K]⁺），m/z 751.5043（绿色，PA O-38:3[M+K]⁺），m/z 796.5831（蓝色，PC 35:1，[M+Na]⁺或PE 38:1，[M+Na]⁺）。

为了解TCBZ在肝片吸虫中的摄取途径和组织趋向性，作者分别观察了肝片吸虫体外暴露于该药物20 min、4 h和12 h的组织切片。如图3所示，TCBZ暴露20 min后，在肝片吸虫的皮层和皮下区可检测到药物（m/z 358.9571），4 h后进一步扩散到薄壁组织和内脏，其中TCBZ在肠表皮皮和卵巢中累积。12 h后TCBZ在整个组织切片中基本均匀分布。

图3 TCBZ在肝片吸虫体内吸收和分布的动态变化。a, H&E染色光学图像。在TCBZ暴露20 min、4 h和12 h后，对肝吸虫切片进行观察，并对肠与肠表皮（i，g）、皮层（tg）、子宫（u）和卵巢（o）进行注释。b, m/z 828.5962（红色，PI O-33:0，[M+NH4]⁺或HexCer 38:0;O4，[M+K]⁺），m/z 358.9571（绿色，TCBZ，[M+H]⁺），m/z 751.5039（蓝色，PA O-38:3[M+K]⁺）。c, MALDI MS TCBZ（绿色）的单通道图像，MALDI MS图像中的箭头表示TCBZ在皮层下区域（20分钟后）、肠表皮和卵巢组织（4小时后，分别为实线和虚线）以及TCBZ阴性的卵子在子宫内聚集（12小时后）。