基质辅助激光解吸/电离质谱成像：高效氢-氘交换实现代谢物准确鉴定

2023-12-21 15:10:06, Create 科瑞恩特（北京）科技有限公司

关键词：MALDI-MSI 质谱成像、Biological databases 生物数据库、Isotope labeling 同位素标记、Hydrogen-Deuterium Exchange 氢氘交换、Metabolomics 代谢组学

前言

基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）是一项广泛应用的技术，可提供组织内的空间定位信息。然而，其与色谱技术的不兼容性导致在结构异构体中鉴定化合物的困难。虽然MS/MS通常用于确定结构，但其通量有限，而且数据库常不完整。氢-氘交换质谱（HDX）长期以来一直用于蛋白质结构分析，最近也应用于小分子分析，用于确定易失性氢原子的数量和区分不同结构异构体。此研究通过氘化基质和加热的MALDI源引入D₂O蒸汽，依赖发生在MALDI激光羽流中的高温和快速反应动力学，来实现快速高效的H/D交换。该方法能够确定MALDI-MS成像中每个分子的不稳定氢的总数。此外，还提出了将HDX数据与METSPACE分析结合的系统方法，以确定或缩小正确的结构异构体范围。

摘要

2022年8月，美国爱荷华州立大学化学系Young Jin Lee团队发表了题目为“Efficient Hydrogen−Deuterium Exchange in Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging for Confident Metabolite Identification”的文章，该研究将高效的氢-氘交换（HDX）应用于MALDI-MSI技术。通过将D₂O蒸汽引入加热的MALDI源并结合氘标记基质，可以实现73%-85%的HDX效率，从而可以正确测定多达17个不稳定氢可能的H/D交换数。结合高通量METASPACE注释，该方法可以系统地改进MALDI-MS成像中的非靶向代谢产物注释。

实验设计

作者在加热的低真空MALDI源中引入D₂O蒸汽，使HDX效率显著提高。将HDX数据与METASPACE分析(一个基于web的质谱成像数据代谢物注释自动平台)相结合，来确定或缩小正确的结构异构体范围。随后作者利用浮萍（Lemna minor），对开发的方法进行了验证。

改进HDX MALDI-MS

在引入D₂O的同时，作者通过将MALDI源外部进行1小时的加热，达到了两方面的目的。首先，去除了吸附在MALDI室金属表面的水，其次，为D₂O扩散到随后的气相HDX源提供了充足的时间。此外，作者还引入了氘代MALDI基质，通过升华应用于样品，以防止在应用过程中发生反向交换。通过将这些步骤结合，包括D₂O蒸汽暴露、外部MALDI源的加热，以及氘化MALDI基质的引入，实现了高效的MALDI-HDX效率。为了评估在短时间内样品中能够有效交换的不稳定氢的数量，作者使用一系列寡糖标准品应用于组织样品，并通过HDX MALDI-MS进行分析。结果显示，麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖的最大可能氘化峰分别出现在11、14和17，表明在MALDI过程中成功实现了多个不稳定氢的高效交换

图1 在浮萍叶片上喷洒氘代糖类标准品显示检测到多达17个H/D交换

比较HDX MALDI-MS中检测到的最大交换量与实际活性氢的数量

为了验证HDX MALDI-MS检测到的最大交换量是否与实际活性氢的数量相符，研究人员在HDX溶液后，对从浮萍提取物中获得的样品进行了直接输注ESI分析。使用METASPACE对从MALDI-MSI数据中鉴定出的56种代谢产物进行分析后，发现其中有36种代谢物也在ESI-MS中出现。这36种代谢物中的每一种都显示出与MALDI中气相HDX方法相同的最大氘标记数。图2展示了[C₄₂H₄₆O₂₃+K]⁺的一个比较例子，其中HDX MALDI-MS和直接输注ESI-MS检测到的最大HDX数量均为15个，表明两种技术在标记的氘数量上具有一致性。

图2 在浮萍质谱成像和提取过程中，MALDI-MS与气相HDX和ESI-MS与[C₄₂H₄₆O₂₃+K]⁺溶液HDX标记氘的比较

高效HDX分析验证浮萍代谢物标注，突显数据库差异并揭示黄酮定位的新见解

作者采用高效的氢-氘交换（HDX）方法深入研究了浮萍的代谢物结构和空间定位。研究证实HDX在检测至少17个易变氢的代谢物中表现出高效性，通过将标记数据与数据库结构对比，发现大多数标注与HDX数据一致，提升了这些标注的可信度（见图3）。对于存在多个标注的代谢物，HDX标记有助于排除不正确的结构，提升正确标注的可能性。一些代谢物在数据库中未被标注，提示了进一步研究的必要性。浮萍底部表面的代谢物与数据库标注更为一致，而顶部表面和中部的标注相对较少。质谱图像（见图4）展示了一些代谢物在对照和最大HDX标记同位素样品之间的比较，强调了HDX在准确分析含有多个易变氢的黄酮类物质中的关键作用。

图3 (a)使用METASPACE在10%FDR下比较顶表面，底表面和中间层，总结了L.minor对照MALDI MSI数据集中注释的代谢物。(b) METASPACE标注与HDX标记数据的比较，以确定其与活性氢的数量是否一致。

图4 浮萍叶片顶部表面中心和底部表面的标品和完全标记同位素的选定质谱图像

结论

该研究引入了一种新的MALDI-MS成像技术，利用在加热的低真空MALDI源中引入D₂O蒸汽和脱氘有机基质的方法，实现了代谢物的高效气相氢-氘交换（HDX）。尽管之前已有HDX MALDI-MSI的报道，但本研究首次将加热源和脱氘基质与D₂O蒸汽结合使用，显著提高了HDX效率，成功确定了低丰度和多个易变氢代谢物的最大易变氢数量。该方法在METASPACE自动注释工具的系统代谢物注释中表现出实用性。在应用于浮萍时，HDX数据成功地从METASPACE对照组织的分析中排除了许多不正确的代谢物注释。

综上所述，作者开发的基于低真空MALDI的高效HDX质谱成像技术，通过提供额外的精确标注，显著改善了大规模代谢组学中的代谢物标注。

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