质谱成像 | 分子网络和组织化学衍生化用于增强MALDI质谱成像对甾体糖苷的鉴定和可视化

空间代谢组学是指在组织和细胞空间背景下对相互连接的代谢途径、生化反应和小分子的转运过程进行分析。然而，许多代谢物类别（例如甾体类化合物）在质谱成像实验中的固有电离效率较低，从而限制了代谢网络的空间表征。此外，由于缺乏规模化的数据库，将复杂的代谢网络分解为化合物类别和分子注释仍然是一个难题。因此，本研究结合计算代谢组挖掘工具和高分辨率的组织化学衍生（OTCD）质谱成像，旨在开发一种多模式质谱方法，以在低微米尺度上对代谢网络进行空间分析。

2022年11月，德国吉森大学 Bernhard Spengler 教授团队在 Analytical chemistry 发表了题目为“Molecular Networking and On-Tissue Chemical Derivatization for Enhanced Identification and Visualization of Steroid Glycosides by MALDI Mass Spectrometry Imaging”的文章，该研究首先结合计算代谢组学挖掘工具和高分辨率的 MALDI MSI 技术，开发了一种多模式质谱方法，用于在低微米尺度上对代谢网络进行空间分析。通过应用大斑蝶中的植物毒素螯合作为模型系统，研究人员首先利用 LC-MS 和 AI 驱动的化学特征化方法，对32种不同的甾体糖苷进行了结构鉴定和分子鉴定。然后，他们开发了一种保留空间信息的组织化学衍生化（OTCD）方法，与未经处理的样品相比，该方法将甾体糖苷的离子产量提高了至少一个数量级。通过这种优化的化学衍生化质谱成像方法，研究人员成功地可视化了大斑蝶中甾体糖苷的（亚）细胞分布，为毒性代谢物的螯合和未来复杂样品系统的代谢组学研究提供了新的视角。

本研究结合计算代谢组学挖掘工具和高分辨率的组织化学衍生化质谱成像（OTCD MSI），在低微米尺度上对代谢网络进行空间分析，具体包括以下两个步骤：

首先对大斑蝶的寄主植物马利筋的叶片进行 LC-MS/MS 非靶向分析，并结合最先进的分子网络工具，利用 AI 驱动的化学特征化方法，获得马利筋的代谢组学谱，并从中鉴定出甾体糖苷类化合物。

开发了一种保留空间信息的 OTCD 方法，提高甾体糖苷的离子产量，为大斑蝶中甾体糖苷的（亚）细胞分布可视化奠定基础。

图S1 利用 OTCD MALDI MSI 原位可视化与马利筋中强心苷螯合作用相关的代谢网络的实验设计。

图1 基于特征的分子网络和计算机系统分类、亚结构预测和注释

表S1 基于LC-MS数据的FBMN分子网络和计算机模拟分子表征测定的马利筋中的强心苷

该研究以5年龄的大斑蝶为研究对象，对其进行纵向切片，在内部代谢组学数据库的指导下对强心苷的吸收代谢网络进行可视化研究。以往的研究表明，因为甾体化合物电离效率差，且在低质量-电荷数（m/z <500）范围内存在干扰分子，所以使用 MSI 结合软电离技术检测对其进行可视化非常困难。因此，该研究使用 GirT 试剂在保留空间信息的同时提高检测灵敏度，开发了 OTCD 方法，利用高试剂浓度和低总喷雾体积和流量，在不增加湿度的情况下进行培养和优化基质应用。GirT 可与含有羰基的强心苷进行反应，生成腙和带正电荷的三乙胺（图2a）。同时，该研究还在相同参数下对相邻部分的切片进行了 MSI 实验（不使用 OTCD 方法，对照组）。

光学图像（图2b）显示了被肠道上皮（GE）、脂肪组织（FT）和外皮（I）包围的含有马利筋植物的大斑蝶肠腔（GL）。图中红色通道代表有毒强心苷 calotropin/calactin（[M+K]⁺ 和 [M+GirT]⁺）的离子信号。绿色通道代表 pheophytin a（[M+K]⁺）的离子信号。蓝色通道代表 PS（36:3）（[M+K]⁺）的离子信号，突出显示肠道上皮和脂肪组织。经 OTCD 法处理的样品，其衍生化离子只检测到携带 GirT 的离子。将两个切片的 MSI 图像进行归一化处理，结果表明，相较于对照组，calotropin/calactin 的平均信号强度增加了16倍，像素覆盖率也提高到了72%（对照组为35%），具体信息见图S10。以上结果表明，OTCD MALDI MSI 显著提高了提取的生物信息，并保证了它们的真实性和空间完整性。因此能够在空间上解析积累的强心苷在被膜单层上皮细胞中的精细分布。

该研究共检测和注释了大斑蝶中19种强心苷衍生物，结果显示，大部分强心苷经吸收后主要储存在幼虫的表皮中，如（calotropin/calactin，图2b），少量乌斯卡定（图2d）、hydroxyuscharidin（图2e）、gofrugoside（图2f）、calotoxin/hydroxycalactin/hydroxycalotropin（图2g）和 calotropagenin（图2h）也储存在幼虫的表皮中。马利筋中含量最丰富的有毒强心苷马利筋苷（图2i）和羟基马利筋苷（图2j）只在肠腔中分布。

图S2 大斑蝶幼虫纵切面光学图像

图S10 对照组和经 OTCD 处理的实验组中强心苷提取离子强度对比箱型图。

该研究通过多模式质谱成像方法，结合计算代谢组学挖掘工具和高分辨率的组织化学衍生化质谱成像（OTCD MSI），在低微米尺度上对代谢网络进行空间分析。研究中首先利用 LC-MS 的分子网络分析方法，结合 AI 驱动的化学特征化方法，对马利筋中的有毒强心苷进行了结构鉴定和分子识别，成功地确定了32种不同的强心苷。然后开发了一种保留空间信息的 OTCD 方法，提高强心苷的离子产量，成功地可视化了大斑蝶中强心苷的（亚）细胞分布。该研究提供了一种新的方法和技术，可以增强甾体糖苷的鉴定和可视化能力，为相关领域的研究提供了新的工具和思路，可以广泛应用于药物研发、天然产物分析等领域，有助于发现新的生物活性物质和药物候选物，也为毒性代谢物的螯合和未来复杂样品系统的代谢组学研究提供了新的视角。

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