《自然-通讯》七叶树基因组揭示七叶皂苷和七叶树生物合成及进化机制

2023年10月，陈士林团队在《自然-通讯》(Nature Communications)发表题目为“Characterization of the horse chestnut genome reveals the evolution of aescin and aesculin biosynthesis”的文章，刊登作者采用本草基因组学研究策略对天然药物七叶皂苷和七叶素特异性合成的分子机制及绿色合成开展研究的相关成果，利用多组学及MALDI质谱成像技术将中药活性成分的生物合成研究提升到空间组学水平。

该研究通过空间代谢组揭示七叶皂苷在娑罗子的子叶中特异性积累，解析了中华七叶树高质量基因组，并通过代谢组学、转录组学以及合成生物学等方法，成功解析七叶皂苷生物合成途径中关键的环化、氧化、酰基化和葡萄糖醛酸化等催化步骤。同时，还通过全被子植物基因组层面共线性研究，发现玉蕊醇型三萜代谢基因簇的招募和进化模式，更好地理解了玉蕊醇型三萜类化合物在无患子科植物中的形成机制。为七叶树的遗传改良和次生代谢产物的合成提供了一定基础，对七叶树的品种改良和药用价值的开发利用具有重要意义。

利用LC-QQQ-MS/MS对七叶树5个不同组织中（树枝、花、叶、果皮、种子）的原七叶皂苷元、七叶皂苷IA、七叶皂苷IB、秦皮乙素和秦皮甲素的代谢谱进行分析。结果显示，秦皮甲素在叶和花中的含量显著高于种子，而七叶皂苷IA和七叶皂苷IB在种子中的含量最高。利用MALDI-MSI对候选代谢物在种子中的分布进行可视化分析，结果表明七叶皂苷IA和其同分异构体七叶皂苷IB （m/z 1169.5152）[C₅₅H₈₆O₂₄ + K]⁺ 在子叶上大量积累。

为了鉴定七叶树中参与三萜生物合成的BGCs，该研究寻找了已知参与这种代谢的OSCs/裁剪酶（例如，最常见的CYP716家族）的基因组区域，发现了4个含有OSCs的BGC和1个含有CYP716基因的BGC，称为AcClustersI-V；这些BGCs参与了七叶树中的三萜生物合成。

共线性分析分析表明，AcCluster II与AcCluster I在物理上是同源的。其中，AcCluster I位于15号染色体上，包含两个OSC同源物（AcOSC6和AcOSC9），7个P450（ACCYP716A274、ACYP7CYP716A276、AcCYP716A277、AcCYP716A278、AcCYP716BX1、AcCYP716BX3和AcCYP716BX6）和350kb区域内的5个BAHD（AcBAHD1-AcBAHD5）。AcCluster II位于8号染色体上，由两个P450基因（AcCYP716A275和AcCYP716BX2）和一个类纤维素合酶基因（AcCSL1）组成。RNA-seq数据进一步显示，1个OSC（AcOSC6），4个P450（AcCYP716A275，AcCYP716A278，AcCYP716BX1和AcCYP716BX2），和3个BAHD基因（AcBAHD1，AcBAHD3，AcBAHD5）在七叶树种子中大量表达，这与七叶皂苷IA/IB的积累规律一致，因此推测其参与了三萜的环化、羟化、葡萄糖化醛酸化和酰化。为了扩大候选基因的范围，进一步进行了WGCNA分析，在turquoise模块发现了1个OSC、3个CSL、9个UGT、13个p450和19个BAHD基因。

该研究从七叶树基因组中鉴定出7个PALs、3个C4Hs、5个C3Hs、4个4CLs、和 5 个 F6''Hs。克隆了3个Ac4CLs (Ac4CL1-3)和4个AcF6''H (AcF6''H1-4)。分光光度法测定结果表明，三种特征的Ac4CL酶对咖啡酸具有催化亲和力，可催化其生成咖啡酰辅酶A，其中Ac4CL2的催化性能最佳。酶学分析结果表明，在以咖啡酰辅酶A为底物时，AcF6''H1和AcF6''H2均表现出羟基化活性。经LC-MS/MS检测，羟基化产物为秦皮乙素。

从七叶树中克隆了19个UGT基因，将其在大肠杆菌中表达，以产生重组蛋白，然后以秦皮乙素为受体，以UDP-葡萄糖为供体底物，研究这些蛋白的酶活性。研究发现AcUGT84A56和AcUGT92G7的催化产物相对于相应的苷元的分子量增加，引起了一个葡萄糖的加入。通过质谱数据比较，确定以秦皮乙素为底物的AcUGTs酶促产物为秦皮甲素。酶动力学试验结果表明，AcUGT92G7 (K_M = 48.96μM)的催化活性强于AcUGT84A56(K_M = 177.25μM)。

该研究利用特征酶Ac4CL2、AcF6’H1和AcUGT92G7组装了秦皮甲素的从头生物合成途径。通过表达四种关键酶来提高莽草酸盐途径中的碳通量。为了减少PEP向丙酮酸的转化，选择了BWΔpykAΔpykF菌株。将BWΔpykAΔpykF与质粒pZE-649T和pCS-TPTA-HpaBC共转化，形成菌株BW1。菌株在发酵0-24h时生长速度较快，24 h后生长速度减慢，72 h时生物量OD600为18.1。随着发酵过程的进行，秦皮甲素的产量也稳步增加。72 h的最终产量达到16.3±0.7 mg/L。

图4 参与秦皮甲素的Ac4CLs、AcF6´H和AcUGTs的功能鉴定，以及秦皮甲素的从头生物合成途径。

A：秦皮甲素生物合成途径中的酶。

B：Ac4CL酶活性测定。

C：AcF6´H酶活性测定。

D：AcUGT92G7或AcUGT84A56生成秦皮乙素的UPLC分析。

E：在大肠杆菌中合成秦皮甲素的人工途径。

F：用菌株XC-6(BW-1, pCS-TPTA-HpaBC, and pET-648T)的生成秦皮甲素的从头生物合成途径。

分布在AcCluster I和AcCluster II中的AcOSC6、CYP716、BAHD IIIa和CSL基因是催化BAT生物合成的关键酶。在AcCluster I和AcCluster II的同源区块中，17对同源基因对的平均K_S值为0.27，与七叶树中的旁系同源基因的K_S较相似，说明了AcCluster I和AcCluster II的重复事件可能来源于AαWGD。共线性分析表明，在七叶树亚科中，AcCluster I和AcCluster II是保守的。

该研究又进一步对21个已发表的植物基因组进行了进化动态分析，包括早期分化的被子植物、单子叶和双子叶基因组。在早期分化的被子植物无油樟中，有64个基因的约1Mb片段，包括CAS基因和一个BAHD IIIb基因。CYP716A成员首次出现在毛茛目物种的相应区域。在与超菊类物种分裂后，除十字花科的一些代表物种外，几乎所有的syntenic segments都保留了至少一个OSC基因。值得注意的是，在葡萄基因组的保守syntenic region发现了10个完整和10个部分OSC基因的大量物种特异性串联重复。BAS/CYP716/BAHD BGC一直存在于超蔷薇类物种种的syntenic region，但会发生动态复制和重组。该研究认为，完整的BAT BGC BAS/CYP716/BAHD/CSL首次在七叶树亚科中组装，即产生BAT的植物。此外，BGC在物种形成过程中经历了进一步的动态进化，如CYP716A和CYP716BX的串联基因复制，以及本文观察到的AαWGD事件中AcCluster I和AcCluster II的群体特异性复制。

为了进一步研究OSCs、P450s、CSLs和BAHDs的进化起源，该研究还构建了ML进化树，证实了BAS、CYP716、CSL和BAHD III基因在三萜生物合成中是保守的。纤维素合酶基因家族系统发育树分析表明，AcCSL与其在漾濞槭和文冠果中的共线基因，以及功能验证的催化葡萄糖醛酸与三萜主干结合的CSLs具有密切的系统发育关系(序列同源性为 44.7% ~ 55.2%)。

综上，该研究提出了基于祖先状态重建的被子植物中BAT BGC的出生、死亡和进化轨迹。（1）出生于早期被子植物：在无油樟中，BGC的祖先包含1个 CAS和1个BAHD IIIb；（2）死亡于单子叶植物：包含CAS等非BAT功能基因的区域被保留，但BAHD IIIb丢失；（3）进化于特定的早期分化的真双子叶植物：BAS经过了进化，并加入了CYP716；（4）死亡于超菊类植物：BGC在这个谱系中消失；（5）BAT BGC在七叶树亚科中的组装：功能性BGC（BAS/CYP716/CSL/BAHD）的形成，导致BAT的产生；（6）BAT BGC的重组和多元化：该BGC通过串联复制和WGD以物种特异性的方式进行动态进化。

https://www.nature.com/articles/s41467-023-42253-y