血液专题 | 你敢信?锻炼身体也会害人?

2024-05-15 19:18:43 北京青莲百奥生物科技有限公司


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肌痛性脑脊髓炎/慢性疲劳综合征 (ME/CFS) 是一种复杂且高度致残的慢性疾病,其标志性特征之一是运动后不适(PEM),即运动后ME/CFS症状会加重。2024年1月,纽约康奈尔大学团队在期刊Journal of Extracellular Vesicles(IF=16)发表题为《Dysregulation of extracellular vesicle protein cargo in female myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome cases and sedentary controls in response to maximal exercise》的研究论文,该研究通过对18例ME/CFS女性患者和17例年龄和体重指数匹配的久坐不动的女性对照者血浆外泌体(EV)进行蛋白组学研究,证明了运动后EV蛋白的变化与ME/CFS症状严重程度密切相关。

文章题目:Dysregulation of extracellular vesicle protein cargo in female myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome cases and sedentary controls in response to maximal exercise

发表期刊:Journal of Extracellular Vesicles

影响因子:16

发表时间:2024年1月

发表单位:纽约康奈尔大学

研究策略

18例ME/CFS女性患者和17例久坐不动的女性对照者,分别在固定自行车上进行最大心肺运动测试 (CPET),分别在基线(0 h)、CPET之后15min和CPET之后24h采集血浆样本,通过尺寸排阻色谱从血浆中分离细胞外囊泡(EV),并使用纳米颗粒跟踪分析 (NTA) 和透射电子显微镜 (TEM) 进行表征,最后通过TMT定量蛋白组学方法对EV样本进行检测分析。

图1 实验设计流程图

结果速递

一、细胞外囊泡(EV)表征分析

纳米颗粒跟踪分析(NTA)表明,EV浓度在健康者中随运动时间增加而增加,ME/CFS疾病患者EV浓度升高但不受运动时间影响(图2a)。透射电子显微镜(TEM)表征EV具有双层膜和“蝶形”囊泡特征(图2b)。

通过TMT定量蛋白组学通检测到862种蛋白质,经过筛选后保留301种蛋白,供进一步分析。与现有EV蛋白数据库(Vesiclepedia数据库和Exocarta数据库)进行交叉分析,观察到超过94%的重叠(图2c, 2d),并能检测到多种已知的EV蛋白标志物(例如CD9、囊泡运输相关蛋白PDCD6IP、热休克蛋白HSP90AA1和HSPA8等)。

图2 EV表征分析

二、ME/CFS患者与对照组运动前后EV蛋白表达比较及功能分析

图3a显示了ME/CFS受试者与对照组的蛋白Log2倍数变化,以及来自10000个自举数据集的95%置信区间和FDR校正结果。FDR校正后,在基线时,6种蛋白均无显著差异;CPET后15min,ME/CFS组13种EV蛋白显著降低,3种EV蛋白显著升高;CPET运动24h后,ME/CFS组有1种蛋白显著升高。

使用ShinyGO 0.76软件对CPET后15min的差异蛋白(DEP)进行功能途径富集分析,结果显示,血小板脱颗粒、活化和聚集是富集最多的途径。其中凝血因子F8和F13A1,纤维连接蛋白FN1以及热休克蛋白HSPA5降低,而ORM1升高。此外,富集分析还揭示了许多DEP在与免疫系统、细胞因子信号传导、适应性免疫系统以及IL4和IL13信号传导等相关通路中过度表达(图3b)。

使用QIAGEN IPA对DEP进行功能分析,最显著富集的五条通路:急性期反应信号、LXR/RXR激活、上皮粘附链接重塑、肌动蛋白细胞骨架信号传导、整合素信号传导。基于三个时间点的Z-score分析对经典通路进行分层聚类产生三个聚类,其中正负值分别反映ME/CFS对通路的预测激活状态(<0:减少,>0:增加,绝对值≥2:显著)。绝大多数都参与肌动蛋白细胞骨架调节,用于细胞间通讯,包括神经和免疫细胞(图3c)。

图3 ME/CFS和对照组在每个时间点和富集分析之间的EV蛋白水平差异

三、组内EV蛋白水平随时间的变化

通过对比不同时间点的蛋白倍数变化来评估ME/CFS 和对照组内EV蛋白水平随时间的变化。发现ME/CFS患者和对照组在15min与0h之间存在显著差异。ME/CFS组发现了63个DEP,而对照组发现了187个DEP,其中45个是共有的(图4a)。进一步分析显示,ME/CFS患者组中特定EV蛋白的丰度增加,与细胞周期和TP53转录调控等通路有关;而对照组的EV蛋白则与肌动蛋白折叠、肌肉收缩和Rho GTP酶等通路相关(图4b)。

图4 运动后15min ME/CFS和对照中 EV 蛋白水平的变化和富集分析

四、组织和细胞类型富集分析

使用Enrichr软件对对照组的187个DEP和ME/CFS患者的63个DEP与包含不同细胞和组织类型的参考基因和蛋白表达数据库进行比较分析,以探索运动后15min EV差异蛋白主要在那些组织或细胞类型中表达。桑基网络分析,对照组中大多数蛋白与成肌细胞和平滑肌有关,ME/CFS患者在肌肉组织中没有显著富集。这表明,运动后通过EV从肌肉组织发出的全身信号传导可能会在ME / CFS患者中被破坏,并有助于他们对运动的病理生理反应。

图5 组织和细胞类型富集分析

五、运动后EV蛋白水平变化与ME/CFS症状和疾病严重程度指标密切相关

通过分析301种EV蛋白在ME/CFS患者体内的变化与特定的临床指标相关性,这些蛋白质水平的变化与患者症状的严重程度评分(SSS)之间存在强烈联系。特别地,肌肉疼痛和关节疼痛的初始调查评分与蛋白质水平的变化存在显著相关性。其中clusterin (CLU)蛋白质与这两种症状呈强烈正相关。研究还发现,与肌肉疼痛相关的蛋白质主要涉及细胞输出和免疫活动,而与关节疼痛相关的蛋白质则与细胞骨架和蛋白质定位有关。此外,运动后某些蛋白质水平的变化与肌痛和疲劳的恶化呈正相关,涉及肌肉收缩、应激反应、炎症和免疫等方面。

图6 运动后EV蛋白质组的变化与 ME/CFS 症状严重程度之间的关联

研究结论

ME/CFS患者在运动后EV蛋白的变化与久坐对照组不同,且某些EV蛋白在运动后的含量变化与特定症状的严重程度有强烈的相关性。此外,与对照组相比,ME/CFS患者在运动后可能存在EV释放失调和异常的情况,这可能与女性ME/CFS患者经历的运动后不适(PEM)有关。

因此血浆外泌体蛋白质组的研究对于理解疾病发病机制和诊断治疗具有重要意义。那么血浆外泌体蛋白质组是如何检测以及如何应用的呢?

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