利用时空代谢组学揭示：二苯乙烯的组织特异性积累是对损伤/嫁接的早期响应

为了研究葡萄嫁接愈合过程中多酚类物质随时间的浓度变化，作者在嫁接后 0h、4 h 、1d、3d、6d和15d分别测定了两种异源嫁接（PN/140Ru、PN/RGM）和三种同源嫁接（PN/PN、140Ru/140Ru、RGM/RGM）砧穗组合在嫁接切面及其上、下方取样位置的 41 种代谢物。如图2所示，测定了不同组织中黄烷醇和二苯乙烯总浓度，在15d内，完整PN插条茎中二苯乙烯和黄烷醇总浓度没有发生变化；然而，在所有的嫁接体或伤口处理样本中，二苯乙烯在嫁接体接口和伤口部位积累，而黄烷醇的浓度随着时间的推移保持稳定或略有下降。

图2 损伤/嫁接对葡萄茎中黄烷醇和二苯乙烯总和的影响。误差线代表平均值±标准差(嫁接 n = 5，扦插 n = 3)。*表示嫁接切面上方与嫁接切面下方之间以及嫁接切面之间存在显著差异（T 检验分析，P < 0.05）

为了进一步了解二苯乙烯在嫁接切面处的积累，作者计算了不同单体、二聚体、三聚体和四聚体浓度的总和。结果显示，二苯乙烯单体、二聚体和三聚体在所有砧穗组合的伤口部位和嫁接切面的积累水平远高于周围的木质组织。从1d开始，140Ru和RGM同源嫁接体及两个异源嫁接体，二苯乙烯单体的积累是连续和显著的，其中以白藜芦醇的积累为主；然而，在15d时，单体的数量与6d时相比明显减少。通常，多聚体在嫁接切面的积累在时间上晚于单体的积累。四聚体仅在结束时在嫁接切面积累，且仅在PN/PN、PN/140Ru和140Ru/140Ru 组合中积累（图3）。

图3 损伤/嫁接对葡萄茎中二苯乙烯单体、二聚体、三聚体和四聚体浓度总和影响的热图。*表示嫁接切面上方与嫁接切面下方之间以及嫁接切面之间存在显著差异（T 检验分析，P < 0.05）

在嫁接后15d内，酚酸、黄酮醇和黄烷醇的定量结果显示，所研究的基因型和/或嫁接体组合之间存在显著差异，柚皮素、二氢槲皮素和表没食子儿茶素没食子酸酯在嫁接体接口或伤口部位发生了特异性积累（图4）。

图4 损伤/嫁接对葡萄茎中柚皮素、二氢槲皮素和表没食子儿茶素没食子酸酯浓度的影响。*表示嫁接切面上方与嫁接切面下方之间以及嫁接切面之间存在显著差异（T 检验分析，P < 0.05）

利用AP-SMALDI MSI 技术，我们能够观察到多酚类物质在嫁接后不同时间（0d、16d和30d）的空间分布。在PN、140Ru和RGM木材（0 d）中，在木质部和髓部之间以及木栓层和韧皮部之间发现了二苯乙烯（如白藜芦醇、α-葡萄素）。虽然代谢物分布模式存在一些微小差异，但总体而言，不同基因型之间目标代谢物的分布情况是相似的（图5和图6）。在研究的嫁接体中，二苯乙烯在受伤组织中积累，而柚皮素、二氢槲皮素和表没食子儿茶素没食子酸酯则在愈伤组织中积累。黄烷醇单体及其二聚体未在嫁接切面处积累。

图5 代表性的葡萄品种PN/ 140 Ru异株嫁接切片照片，(a) 嫁接后 16 d和 (b) 嫁接后 30 d ，其质谱成像图 (MSI) 分别为 m/z 227. 0708、m/z 677.1812、m/z 457.0771 和 m/z 271.0607，分别对应于白藜芦醇、α-葡萄素、表没食子儿茶素没食子酸酯和柚皮素。红色框内为分析区域。Sc，接穗；Rt，砧木；C，形成层；B，木栓层；Ph，韧皮部；X，木质部；Pi，髓。

    图6 异型株PN/RGM嫁接时（a）嫁接后16 d和（b）嫁接后30 d的切片，(a) 嫁接后 16 d和 (b) 嫁接后 30 d ，其质谱成像图(MSI)分别为 m/z 227. 0708、m/z 677.1812、m/z 457.0771 和 m/z 271.0607，分别对应于白藜芦醇、α-葡萄素、表没食子儿茶素没食子酸酯和柚皮素。Sc，接穗；Rt，砧木；C，形成层；B，木栓层；Ph，韧皮部；X，木质部；Pi，髓。

关于白藜芦醇，我们观察到白藜芦醇在16 d时沿着嫁接切面区域积累，这与嫁接设备的“Ω”形状相对应（图5a和6a）。这种积累特别明显，尤其是在 PN和RGM基因型组合中的木质部薄壁组织中。然而，在 140Ru 基因型中，除了在整个木质部区域积累，在髓部也有积累（图5a）。

AP-SMALDI MSI 的可视化结果显示，其它多酚类代谢物在嫁接切面处呈现出了不同的积累模式（图4）。在所有嫁接体中，表没食子儿茶素没食子酸酯在16 d时在形成层特异性积累，30 d时在各组织中的分布更为分散；柚皮素或二氢槲皮素很容易被 MALDI-MSI 检测到，并广泛分布于各部位且在形成层积累到较高水平，特别是在PN/140Ru异源嫁接体和RGM同源嫁接体的髓部（图5b和图S2-S11）。 

图7 白藜芦醇（黑色）处理(2.5 g L^-1）和水（灰色）对葡萄嫁接成功率的影响。

为了确定白藜芦醇在嫁接愈合形成过程中的作用，作者进一步将接穗和砧木的切面浸入白藜芦醇溶液中（图7），结果表明白藜芦醇处理没有提高砧穗组合的嫁接成功率。

图8 嫁接后两周内嫁接切面上白藜芦醇、儿茶素/表儿茶素和柚皮素的（a）空间变化和（b）时间变化。（a）图中所示为PN/140 Ru的切片，质谱成像图（MSI）为m/z 227.0708、m/z 289.0712和m/z 271.0607，分别对应白藜芦醇（红色）、儿茶素/表儿茶素（绿色）和柚皮素（蓝色）。红色框内为分析区域。Sc，接穗；Rt，砧木；C，形成层；B，木栓层；Ph，韧皮部；X，木质部；Pi，髓。（b）嫁接界面与周围木质组织在嫁接后 0h、4h、1d、3d、6d 和 15 d的热图。