天美讲堂丨什么是FLIM-荧光寿命成像?

荧光寿命成像（FLIM）是一种成像技术，样品荧光寿命的变化在图像中产生对比度（图1）。FLIM广泛用于生物医学成像，其中组织和细胞用一种或多种荧光染料染色。染料的荧光寿命取决于局部微环境，FLIM比其他成像技术（如宽场成像）提供了额外的维度，如环境信息。FLIM也越来越多地用于研究光致发光材料，例如对纳米材料、太阳能电池和半导体的载流子寿命变化进行成像。

图1  使用RMS1000共聚焦显微拉曼光谱仪测量（a）小鼠肠道切片和（b）小鼠肾脏切片的FLIM图像。

FLIM成像是使用共聚焦显微镜获取的（图2）。显微镜配备有脉冲激光器，激光由物镜聚焦到样品上形成一个小斑点。使用滤光片或单色仪（图2的排列方式）选择来自样品的荧光，并使用单光子计数检测器如光电倍增管（PMT）进行检测。

图2  FLIM共聚焦显微镜

荧光衰减是使用时间相关单光子计数（TCSPC）获得的。在TCSPC中，用脉冲激光激发样品，并测量激光脉冲和检测到的荧光光子之间的时间（图3a）。该过程重复数百万次，以创建荧光光子计数与到达时间的直方图（图3b）。

图3  （a）使用TCSPC记录单个光子到达时间；（b） 单个像素的荧光衰减直方图；（c）感兴趣区域内逐个记录像素的荧光衰减直方图。

计算每个像素荧光衰减直方图的荧光寿命。通常用最小二乘法将单指数模型拟合到每个衰减来计算，以获得荧光寿命τ（图4）。将通过拟合获得的荧光寿命对应到颜色图上，构建颜色编码的荧光寿命图像。

图4  计算FLIM数据，每个像素的荧光寿命对应颜色变化，构建颜色编码的荧光寿命图像。