浅谈SYBR Green染料法进行相对定量实验时的注意事项

SYBR Green 染料法无需设计合成探针，可降低检测成本，但是需要格外注意的就是可能会产生假阳性信号，因为SYBR Green染料可与任何的双链 DNA 发生结合，因此也会与非特异性的双链 DNA 序列，或者引物二聚体发生结合。因此，使用经过精心设计的引物及高质量模板极其重要。为了质控扩增产物的特异性，建议在扩增实验后进行熔解曲线分析。

为了提高引物与靶序列结合效率，在引物设计时需要避免引物结合区域含有SNP位点（单核苷酸多态性位点）。针对人和鼠的目标基因，可以使用诸如SNPmasker软件等对靶序列进行SNP位点的注释，如图2所示（网址为：bioinfo.ut.ee/snpmasker/）。

图2 利用SNPmasker软件注释靶序列的SNP位点

为了提高引物结合的特异性，在引物设计时需要避开目标序列中存在的高度重复区域。针对人、鼠等经典模式生物的目标基因，可以使用诸如RepeatMasker软件等对靶序列进行重复序列的注释，如图3所示（网址为：http://repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker）。 

图3 利用RepeatMasker软件注释靶序列中的重复序列

用于 RT-qPCR 中 qPCR 步骤的 PCR 引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接（图4）。由于含内含子的基因组 DNA 序列不会被扩增，因此这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性的风险。建议利用无 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶处理 RNA 样品以除去基因组 DNA 污染。

图4 推荐跨越外显子设计qPCR引物以减少基因组污染

在设计好引物序列后建议使用NCBI-Blast工具对引物特异性进行评估，确保所设计引物只特异性靶向待研究物种中目标基因片段，如图5所示（网址为：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）。

图5 利用NCBI-Blast工具对引物特异性进行评估

在相对定量实验过程中我们会用到内参基因（Endogenous Control），它在所有的实验样本中稳定表达，不受实验处理影响，在相对定量实验中起到校正上样量和上样过程中存在的实验误差，保证实验结果准确性的作用。需要明确一点的是，内参基因并不能与管家基因（House Keeping genes）直接划等号，如下图所示（图6），虽然都是常见的管家基因，但是在不同人体组织中表达差异很大。在挑选内参基因时我们可以先参考文献，提前查看一下与我们检测样本相似，实验处理条件相同时大家一般选择哪些基因作为内参基因。随后需要用我们待检测样本进行预实验测试，在保证实验条件和正式实验完全一致的情况下，选择Ct值标准偏差最小的候选基因作为我们实验的内参基因。

图6 不同管家基因在人体不同组织中的表达变化

（doi: 10.1016/j.bbrc.2003.11.177）

SYBR Green染料法实验在正式大规模进行实验前，需要对引物终浓度进行摸索。我们可以根据所使用扩增试剂盒说明书推荐浓度范围，设置多个上下游引物终浓度进行预实验，随后结合扩增曲线Ct值和熔解曲线峰型图，挑选扩增灵敏度高，特异性强的上下游引物浓度对（图7）。

图7 引物浓度筛选

在开展正式实验前，我们建议老师准备目标基因和内参基因的标准品，通过标准曲线法实验获得它们的扩增效率这一重要参数（图8），理想条件下最佳的扩增效率为100%，一般可接受的范围是90-110%（http://miqe.gene-quantification.info/）。通过扩增效率，用以评估整个反应体系的配比，扩增程序的设置是否是最佳等。

图8 绘制标准曲线获得扩增效率参数

在进行相对定量实验时，主要有两种方法，即相对标准曲线法和comparative Ct 法（ΔΔCt or ddCt）。通常我们对ΔΔCt法比较熟悉，但是您知道选择这种方法的前提吗？它需要目标基因和内参基因的扩增效率都接近100%，且二者拟合标准曲线的斜率不超过10%。如果不能满足这两方面要求，那么相对定量实验就需要通过相对标准曲线法来实现了（图9），也就是需要准备好目标基因和内参基因的标准品，并梯度稀释，建立两者的标曲，随后通过标曲进一步推算目标基因在实验组与对照组间的差异，如图10所示。

图9 根据扩增效率选择合适相对定量方法

 图10 ΔΔCt和相对标准曲线法算法比较

经过上述介绍我们可以发现SYBR Green染料法进行相对定量实验时虽然易于开展，但需要花费大量时间和精力去测试和优化实验，从引物设计到内参选择，再到扩增效率的确定，可谓过五关斩六将，那么如果我们情况急任务重，就没有快速开展实验的捷径了吗？答案当然是有啦，选择我们TaqMan Gene Expression Assay就可以了。

TaqMan Gene Expression Assay是qPCR 基因表达研究的金标准，具有20多年的使用经验。每种Assay均包括目标引物和序列特异性探针，它们已经过优化从而获得较佳的功能表现，无需额外设计、优化或熔解曲线分析。搭配推荐的TaqMan基因表达预混液就可以直接开展试验了，不管是科研还是工业开发，都可以大大加速和助力我们的实验进程。