J Exp Clin Cancer Res | 单核RNA测序联合蛋白质组学揭示宫颈癌不同阶段肿瘤微环境

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研究背景

宫颈癌Cervical cancer (CC)是全球第3种女性最常见的癌症， 免疫检查点抑制剂治疗已被推荐作为PD-L1阳性肿瘤的二线治疗，多组学和单细胞RNA测序技术的最新进展对肿瘤微环境 (TME)的特征做出了重大贡献。然而，免疫病理特征不明确导致特异性免疫治疗策略选择依旧困难。对不同阶段CC的TME的所有细胞类型进行分析以了解其细胞生物学的努力仍然有限。

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前言

2023年01月，澳大利亚阳光海岸大学生物创新中心单位王天方在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research期刊发表的题为 “Single-nucleus RNA sequencing and deep tissue proteomics reveal distinct tumour microenvironment in stage-I and II cervical cancer”（IF：11.3）的研究成果，通过单细胞RNA测序联合蛋白质组学等研究方法，揭示宫颈癌不同阶段肿瘤微环境特征。

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研究方法

研究材料

（1） 宫颈癌肿瘤：I期(n=4)

（2） 宫颈癌肿瘤：II期(n=3)

研究技术

（1） 单细胞转录组学

（2） 蛋白质组学

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研究思路

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研究结果

1.  I、II期宫颈癌肿瘤细胞成分的鉴定

作者分别使用从I期(n=4)和II期(n=3)捐赠者的肿瘤组织中分离的所有核进行了单细胞测序（SnRNA-SEQ）实验，经质量控制，非监督聚类分析后，确定了细胞类型样本均质性，比较了两个阶段不同细胞类型的比例。分析了差异表达基因(DEG)以确定细胞类型（图1）。

 图1 I、II期宫颈癌患者肿瘤组织的SnRNA-seq分析

2. CCII患者TME中巨噬细胞以免疫抑制和促肿瘤生长表型为主 

差异基因表达分析显示，CCII组中许多趋化因子、细胞因子和白细胞介素性细胞因子表达显著增加。GSEA分析上皮-间充质转化(EMT)是最丰富的途径，与细胞骨架发育密切相关的P53信号通路、肿瘤坏死因子α信号传导通路和细胞凋亡通路在CCII组中均有表达。CCI组干扰素诱导蛋白编码基因的上调强烈支持干扰素-α和干扰素-β反应通路的激活 (图2)。

图2 CCI组和CCII组巨噬细胞的表现出不同的免疫应答水平

3. CCI组和CCII组巨噬细胞异质性分析 

进一步分析巨噬细胞亚型以揭示细胞异质性在两个阶段之间的变化。有五个亚型被鉴定。比较了与巨噬细胞功能相关的选定基因在各亚型中的平均表达。最后投影到Monocle3定义的二维状态空间进行伪时间分析，以推断巨噬细胞发育的谱系轨迹。这在很大程度上反映了细胞因子介导的信号在CCI组State-9细胞中的激活；相反，ECM-受体相互作用和PI3K-Akt信号在CCII State-9细胞中更为明显(图3)。

图3 CCI组和CCII组巨噬细胞异质性分析

4. CCII患者TME中T细胞功能受到抑制 

T细胞分为CD8 + T、γδT细胞和T reg T细胞。CCI组CD8 + 细胞数高于CCII组(图4B)。两组之间的三个T细胞群的分布在2D-tSNE空间中显示(图4C)。CD8 + T细胞分为五个主要亚型，图4D显示了前100个DEG在两组的三个T细胞群体中的等级聚集。CCI组CD8 + 细胞中与干扰素反应密切相关的几个基因在CCIγδT细胞中表达上调，与抗原提呈有关的两个基因(CD38和CD48)在CD8T和T细胞中表达上调，而在γδT细胞中表达下调。CCII组CD8 + T和T reg T细胞的数量显著高于CCI组(图4)。

图4 CCII患者TME中T细胞功能受到抑制

5. CCII患者TME中的B细胞和DC表现为MHC-I类抗原反应受到抑制 

作者进一步发现CCI组DC数量更多，而CC II组的B细胞数量更丰富(图5A)。MHC-I类抗原处理相关的选定DEG在CCI组的B细胞中上调(图5D)。CCII组的天然B细胞中存在COL3A1、COLA1和COLA2的升高(图5e)。CCI组B细胞中与I型和II型干扰素信号相关的两组基因上调， CCII组天然B细胞的IL-18信号和趋化因子活性明显增强。CCII组B细胞胸腺间质淋巴生成素(TSLP)和B细胞受体信号过度表达 (图5)。

图5 CCII患者TME中的B细胞和DC表现为MHC-I类抗原反应受到抑制

6. CCI组NK细胞活化程度较高 

NK细胞群分别占CCI和CCII细胞的2.52%和0.85%。KEGG表明CCI组的大多数NK细胞表达与激活的NK细胞功能正相关的标记基因的水平较高 (图6A)。CCII组NK细胞表达调控IL17和肿瘤坏死因子信号的基因，表达活化的NK细胞标记基因的细胞在2D-tSNE空间中的分布表明(图6B)。与趋化因子和细胞因子信号转导相关的DEG在CCI组中的平均表达和表达百分比大多升高(图6C)。GSEA提示“自然杀伤细胞介导的细胞毒性”是CCI组唯一丰富的KEGG途径(图6d)。因此，在免疫应答方面，CCI NK细胞比CCII组更活跃(图6)。

图6 CCI组NK细胞活化程度较高

7. CCI和CCII患者的癌细胞具有明显的异质性 

干细胞和上皮细胞被认为与肿瘤进展相关的几种细胞类型。CCII组的间充质干细胞(MSCs)数量较高。而CCII组脂肪基质细胞(ADSCs)比例较低 (图7A)。GSEA发现提示CCI组CSCs中富含的前6条途径与免疫反应有关 (图7C)。相反，与细胞生长相关的通路在CCII CSCs中高度激活。转化生长因子β信号和细胞外基质组织在CCII组的ADSCs中更为丰富，而CCI组的ADSCs中检测到离子膜转运的激活(图7D)。与多种癌症相关的信号通路是在基底细胞和上皮细胞中都丰富的KEGG通路之一 (图7E和7F)。值得注意的是，在CCII组的这些细胞中，胶原蛋白的表达总体上是上调的，角蛋白也是如此，除了淋巴管内皮细胞，提示它们在临床诊断中有潜在的应用价值(图7)。

图7 CCI患者TME中肿瘤相关干细胞(TASCs)和上皮细胞的免疫反应更为活跃

8. 定量蛋白质组学分析显示CCII患者存在显著的免疫抑制 

CCI和CCII组共鉴定出14,855种蛋白质 (图8A)。CCII组显著上调的DEPS表现出高度的相互作用，其中AKT1是最高的，与其他几个与细胞外基质发育相关的高度节点相互作用 (图8C)。MMP9与免疫相关节点之间存在相互作用。GSEA显示，CCI组干扰素-α和干扰素-β反应丰富，而CCII组通过NFαB的肿瘤坏死因子κ信号丰富(图8D)。然后，我们比较了在干扰素-α反应通路上检测到的编码DEP的基因在免疫细胞中的表达，结果表明，巨噬细胞、T reg 、NK、B细胞和DC表达较多，其中巨噬细胞的表达水平最高(图8e)。CCII组中与免疫过程相关的前20个显著调控蛋白质的FC值(基于GO项)与它们的基因在不同免疫细胞群中的表达相关(图8F)。因此，总体而言，相对于CCI患者，CCII组形成了更具免疫抑制作用的TME。

图8 定量蛋白质组学分析显示CCII患者存在显著的免疫抑制

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研究结论

这项研究使用SnRNA-seq分析比较了I期和II期CC患者TME内的细胞异质性和功能。结果发现，CCI表现出明显的促炎功能，表现为明显激活的干扰素-α和干扰素-γ反应信号，而CCII的巨噬细胞表现出许多与细胞生长和组织发育相关的通路的激活。CD8 + T细胞在CCI组较低，T reg 和γδT显著减少。免疫反应，尤其是MHC-I类途径，在CCI组的DC和B细胞中更为明显，而CCII组的代谢和发育过程更丰富。CCII组NK细胞比例较CCI组降低60%以上，多项指标NK细胞功能上调。CCI组的免疫反应相关途径普遍丰富于几种干细胞类型，而CCII组的细胞和组织生长以及代谢途径高度丰富。此外，定量蛋白质组学显示CCI组干扰素-α和干扰素-γ反应信号被激活，这与SNRNA-seq分析观察到的结果一致。

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在这项研究中， 作者用SnRNA-seq和无标记定量蛋白质组学方法比较研究了I期和II期CC患者的TME。巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞和树突状细胞等几乎所有免疫细胞的异质性在很大程度上受到调节，其表型具有明显的免疫抑制作用。在方法学上使用了定量蛋白质组学进一步验证了单细胞转录组的结果。这些发现为CC的临床诊断和免疫治疗提供了重要线索，值得学习。

参考文献  DOI: 10.1186/s13046-023-02598-0