亚硝胺类基因毒性杂质

亚硝胺类杂质潜在来源

在特定工艺条件，出现某类原料、起始物料和中间体的情况下，亚硝胺杂质可能在API生产过程中形成。这些杂质在后续的API生产工艺步骤中可能无法全部清除。

胺类物质和亚硝酸盐的反应

使用亚硝酸钠（NaNO2），或其它亚硝酸盐，当存在仲胺或叔胺时，可能会形成亚硝胺物质。仲胺可能会在试剂和溶剂中以杂质或降解物出现。它们可能是试剂、溶剂、API、其降解产物和前体结构的一部分。例如，酰胺类溶剂可能降解成仲胺，而仲胺则是亚硝胺物质的来源（如二甲基甲酰胺DMF、N-甲基吡咯烷酮NMP或N,N-二甲基乙酰胺DMA）。叔胺包括常见碱，已发现会生成亚硝胺（即三乙胺、二异丙基乙胺DIPEA）。但是其它不常见的碱有时亦会用于生产工艺，例如NMM、TBA和许多其它均可能导致形成不同亚硝胺物质。叔胺在许多API和其前体中亦是常见的功能团。仲胺和叔胺亦可能作为季胺盐如四丁基溴化铵TBAB的杂质或降解产物出现，甚至出现在伯胺如一乙胺中。还应考虑其它含胺类功能的试剂生成亚硝胺的潜在风险。

在目前大多已确认的亚硝胺污染API案例中，亚硝酸来源和胺类物质被用在了相同步骤中。但是，其它案例亦识别出如果亚硝酸钠在一步中用作试剂，被带入后续步骤中，虽然有很多精制操作，但仍会与胺类物质反应生成亚硝胺杂质。由于不能完全排除其从一步带入后续步骤的可能性，所有使用亚硝酸钠（或其它亚硝酸来源）的工艺如果在任何合成步骤中出现胺类物质（参见上例），则均应考虑生成亚硝胺杂质的风险。

原料污染

如果在生产工艺中使用了受污染的原料，亚硝胺物质亦有可能出现在API中。如果在回收过程中有胺类物质出现，并且后续这些物料采用亚硝酸淬灭以破坏残留叠氮物，但没有足够措施控制亚硝胺形成或足够纯化操作时，回收溶剂、试剂和催化剂可能会有形成亚硝胺的风险。已发现的受亚硝胺物质污染的回收物料例子包括邻二甲苯和三丁基氯化锡（用作叠氮化三丁基锡来源）。还发现DMF可能由此途径污染。亚硝胺物质如果与被回收物料具备相近的沸点或溶解特性，根据回收和后续纯化步骤的不同（例如，水洗或蒸馏），亦有可能会被带入。

生产交叉污染

物料回收（如溶剂、试剂和催化剂）通常外包给第三方。在此情形下，第三方回收场所并没有收到关于其处理的物料成分的特定信息，依赖于其在非专用设备中所执行的常规回收工艺，如果设备在处理不同客户产品时未经过充分清洁，或未采取预防措施避免亚硝胺物质形成，则可能会导致不同来源或不同工艺的溶剂、试剂和催化剂交叉污染。

另一种亚硝胺物质来源是起始物料可能受到污染，包括由使用了会导致亚硝胺形成的处理方法或原料的供应商提供的中间体。例如，亚硝酸盐是原料，包括试剂、溶剂和辅料中已知杂质。来自供应商的原料和起始物料被污染时特别具有挑战性，因为生产工艺不会形成亚硝胺化合物的API生产商可能并不了解此类杂质出现的风险

药品中的“亚硝胺类杂质”如何检测？

最近EMA发布的“MAH须知-亚硝胺信息”和该文件的问答中强调：任何情况下，MAH如发现在某药品中出现亚硝胺物质，无论检出数量高低，均应通知药监当局。这对于亚硝胺类杂质检测方法的专属性和灵敏度提出了更高的要求。美国FDA先后发布了5次关于检测药物中亚硝胺类杂质的参考方法，总结下来无非是两个思路。

一个是使用GCMS进行检测，可以使用单杆和三重四级杆，根据药物的溶解性的差异可以选择直接进样或者顶空进样的方式。

另一个思路是使用LCMS，因为FDA发现一个第三方实验室所用检测方法使用了较高温度，而较高温度会使得雷尼替丁药品生成非常高水平NDMA。

FDA已发布过的ARB药品中亚硝胺杂质的GCMS检测方法因为会加热样品可能会导致NDMA生成，所以不适合检测雷尼替丁。FDA建议使用LC-HRMS检测方法来检测雷尼替丁样品，来排除检测过程中出现的假阳性。

基于国际检测方法与国内外最新政策要求及科研成果，ICAS英格尔实验室严格按照NMPA、GLP、GCP、ICH、OECD等国内外法规进行运营与管理。现已开发了完善的7种亚硝胺类基因毒性杂质的LCMSMS通用方法，完成多种不同的药物中的亚硝胺类杂质的方法开发和验证。LCMSMS三重四级杆质谱具有较强的专属性和灵敏度，特别是AB Sciex 5500及以上系列质谱，由于二级质谱可以采集多个离子对信息，对于亚硝胺类杂质可以更准确地进行定性确认。同时，UPLC和AB Sciex 5500联用的方法时间更短，检测效率更高。