诺华盘点 | AAV 空壳率表征和鉴定分析方法

使用ddPCR和ELISA检测空壳率的原理很简单：ddPCR测量DNA浓度（载体基因组/mL），ELISA测量蛋白浓度（衣壳数/mL），并计算出DNA与衣壳的比率（载体基因组数/衣壳数）以给出完整和空衣壳数。

虽然这种方法简单易用，不需要特殊的设备，但是也有其局限性。首先，ddPCR无法定量测定部分衣壳。根据引物设计和部分基因组的序列，如果引物能够识别部分基因组，这将导致对完整衣壳数量的高估；或者，引物无法识别部分基因组，从而对空衣壳数量高估。第二，ELISA依赖于抗体，抗体可能识别衣壳片段，并且可能存在批次之间的差异。较差的标准曲线可能影响经计算的出的病毒滴度。最后，联合使用ddPCR和ELISA作为空壳率检测涉及两种独立技术的结合，检测结果包含两个误差来源的叠加，最终导致结果偏差大。

紫外可见光谱法（UV-Vis spectroscopy）利用DNA基因组和蛋白质衣壳的摩尔吸光系数，计算样品中DNA和蛋白质的含量。软件可以计算载体基因组和衣壳的数量，并且像ddPCR和ELISA一样，测量空衣壳和满衣壳的比例。由于部分壳体无法与空壳体和满壳体分离，因此，部分衣壳的信号则被归类为空衣壳和/或满壳体。

由于没有对衣壳进行分离，DNA和蛋白质杂质都会影响紫外可见光谱读数。根据我们的经验，对于非常纯净的样品，紫外可见光谱法的准确性很高。然而，即使是最纯净的样品，紫外可见光谱法通常会明显高估空衣壳的数量。紫外可见光谱可能对于那些追求快速，但不一定准确滴度值检测的研究人员来说是一个有效的方法。

SEC-MALS（Size Exclusion Chromatography-Multi-Angle Light Scattering）将排斥色谱（用于将单体AAV与二聚体、聚集体和其他杂质分离）与一套分析检测器（如光散射、紫外检测和折射率检测器）结合在一起，检测溶液中AAV的大小、衣壳滴度和基因滴度。然而，由于空衣壳、部分衣壳和完整衣壳一起在单体峰中洗脱，类似于UV-Vis，SEC-MALS会将部分衣壳的信号分配在空衣壳和完整衣壳之间。

根据我们的经验，SEC-MALS是一种具有合理线性且可重复性的强大分析技术。就其不足之处而言，我们发现SEC-MALS有时会高估空衣壳数量，且软件有时略难用。由于SEC-MALS无法区分部分衣壳，因此对于部分衣壳较少的AAV项目可能更加合适。

在阴离子交换色谱AEX/AEC ( Anion exchange chromatography）中，带负电荷较多的完整衣壳和部分衣壳比空衣壳在柱子上停留的时间更长。好的AEX方法，空衣壳和完整衣壳能够以基线分辨率相互分离。作为一种基于柱的方法，AEX易于操作，稳健且准确。

然而，建立AEX方法可能具有挑战。柱子的选择、盐类型、浓度和缓冲液的pH值都会影响分离质量。另外，某些血清型难以通过AEX进行分析。

毛细管等电聚焦cIEF（capillary isoelectric focusing）方法可以根据pI值不同在pH梯度中分离空衣壳和完整衣壳。好的cIEF方法，空衣壳和完整衣壳可以被分离，从而实现定量分析。cIEF需要高纯度的样品，因为杂质峰可能不容易与蛋白质信号区分开。虽然cIEF可以提供样品中电荷异质性的高分辨率信息，但完全分离空衣壳和完整衣壳可能具有挑战性。翻译后修饰可能会导致峰彼此合并，进一步加大了分析的复杂性。

Maurice icIEF独有的自发荧光模式（Native Fluorescence）可更加有效地监测AAV空壳率等关键质量属性，为您的基因治疗产品保驾护航。USP（美国药典委员会）曾评估使用Maurice icIEF自发荧光模式有效定量检测AAV空壳率（如下图所示）。自发荧光模式基于色氨酸本身所发出的天然荧光，有诸多优势：

• 灵敏度更高：比传统cIEF的UV280光吸收模式灵敏度提升4倍

• 无需添加染料

• 可对工艺样品直接检测，无需预处理

• 有效排除两性电解质和杂质干扰

图片来源：USP activities on AAV: Standards and characterization of AAV full-to-empty particle

沉降速率-分析性超速离心法SV-AUC是一种离心法，通过Svedberg系数将AAV分离，该系数是颗粒质量、大小和形状的测量指标。大体上，空衣壳的Svedberg系数低于完整衣壳。除了能够高分辨地分离空衣壳和完整衣壳外，SV-AUC还可以分离部分衣壳。

然而，在GMP环境中实施SV-AUC是具有挑战性的。它需要大量的人工操作，数据分析也很耗时。尽管如此，由于该方法能够准确地分离和量化空衣壳、部分衣壳和完整衣壳，SV-AUC是许多AAV项目的检测金标准。

CDMS（Charge detection mass spectrometry）是一种新兴的质谱技术，能够同时确定完整衣壳的质荷比（m/z）和电荷（z）。将这两个值相乘可以确定完整衣壳的质量m。对于一个5.1 MDa的完整衣壳来说，m/z值为30,000，电荷为+170（30,000 m/z * 170 z = 5,100,000 Da）。根据我们的经验，CDMS和AUC的结果非常接近，这意味着在分析实验室中CDMS可能作为AUC的替代。

原子力显微镜AFM（Atomic force microscopy）使用悬臂臂杆来检测沉积在成像表面上AAV的理化特性。空衣壳比完整衣壳更加“软”且看起来更小。也可以观察到疏水性和表面电荷的差异。然而，由于空衣壳和完整衣壳的可能重叠或差异微小，AFM更适合作为一种表征方法，而不是用于定量空壳率的方法。

冷冻透射电子显微镜CryoTEM（Cryogenic transmission electron microscopy）是一种成像技术，用于检测AAV衣壳内的电子密度。完整衣壳由于存在DNA在其内部，因此具有高电子密度（高对比度），而空衣壳则几乎没有对比度。CryoTEM还可以将介于低对比度（空衣壳）、中等对比度（部分衣壳）和高对比度（完整衣壳）之间的衣壳定量，但是需要一个好的算法来决策出何为低对比度、中等对比度或高对比度的衣壳。我们还观察到，CryoTEM可能会高估样本中空衣壳的数量。

质量光度法Mass photometry是一种成像技术，通过观察AAV落在显微镜载玻片上时散射的光量（或对比度增加）来进行分析。相比空衣壳，完整AAV在显微镜载玻片上会显示为较暗的斑点（具有更大的对比度）。通过测量落在显微镜载玻片上的AAV数量以及落点事件的对比度或强度，可以确定空衣壳与完整衣壳的比例。

质量光度法的优点是它是一种快速且易于操作的技术（每个样品约五分钟），同时作为一种单分子技术，它提供了关于样本异质性的详细信息。然而，尽管质量光度法可以区分部分衣壳，但其分辨率不高，这意味着部分衣壳和完整衣壳的分布可能相互重叠。我们利用该仪器平台的初步结果表明，质量光度法可能会错误地将部分衣壳误判为完整衣壳。