Cell | 吲哚-3-甲醛促进肿瘤免疫治疗有奇效！

选择长双歧杆菌（Bl）、罗伊氏乳杆菌（Lr）、约氏乳杆菌（Lj）和大肠杆菌（Ec）四种常用益生菌，加入到临床前黑色素瘤模型的无菌小鼠的日常饮食中，以测试其抗肿瘤潜力。结果显示，在肿瘤细胞移植（TCE）后1天开始每天口服Bl、Ec或Lr，可有效抑制黑色素瘤的生长，且生存率增加。而Lj未能介导肿瘤抑制，表明共生体抑制肿瘤生长的能力是特定物种的。且Lr是模型中具有最强肿瘤抑制能力的益生菌。通过流式细胞仪对早期（TCE后第9天[pTCE]）、中期（TCE后第11天）和晚期（TCE后第17天）的免疫反应进行分析，评估Lr治疗在整个肿瘤发展过程中的全身免疫调节效果。结果显示，在评估的所有时间点，Lr治疗使肿瘤微环境（TME）向抗肿瘤性、免疫刺激性环境倾斜，其特点是产生干扰素γ（IFNγ）的Th1细胞（IFNγ⁺CD8 T细胞）和Tc1细胞（IFNγ⁺CD8 T细胞）的扩张，总之，Lr能有效地增强抗肿瘤免疫（图1）。

图1. Lr诱导抗肿瘤免疫并促进临床前黑色素瘤的ICI

在肠道肿瘤中存在肿瘤微生物组，并且已经从乳腺和胰腺患者的肿瘤中找到了活的细菌。然而，瘤内菌是否是影响肿瘤发展的主动媒介尚不清楚。为此，在Lr选择性培养基中培养肿瘤匀浆物，并在服用Lr的小鼠的所有肿瘤中均检测到活的Lr。为了探究Lr如何影响肿瘤微生物组的组成，采用广谱培养法模拟肿瘤微环境（TME）中的微生物分布，在有氧/厌氧培养条件下使用不同营养成分的肉汤和琼脂，使各种细菌得以恢复。虽然在对照组小鼠的肿瘤中检测到了各种活菌，但Lr处理的小鼠肿瘤显示TME中的微生物多样性在不断下降，而Lr逐渐取而代之，表明外源性Lr灌胃驱动转位并维持肿瘤微生物组。还发现Lr在GF和SPF条件下都会转位到全身组织，包括肝脏、脾脏和肠系膜淋巴结（MLNs），这意味着Lr通过血管和淋巴途径转位。在肿瘤内检测到口服的大肠杆菌Ec，但未检测到益生菌Bl，证明细菌转位到TME并不是Lr所独有的。总之， Lr转移到肠道末端肿瘤的机制不受分类学的限制，并且独立于已建立的微生物群、肿瘤形成和肠道屏障功能障碍。

瘤内（IT）注射单剂量的Lr，并分析其在肿瘤发展过程中的TME丰度，结果显示，虽然Lr没有扩大，但在Lr注射后15天内都能从肿瘤中培养出存活的Lr，证明Lr在TME内的定植是持续的；且肿瘤的密度并未随肿瘤的大小而增加；TME为Lr提供了一个可持续的生态位，肿瘤内的Lr足以促进抗肿瘤免疫；且瘤内注射Lr到已建立的肿瘤中，显著抑制肿瘤生长，提高肿瘤内Tc1的频率，并延长生存期。使用氨苄西林（AMP）和万古霉素（VAN）以评估对瘤内Lr是否是必需的。结果显示， AMP会消耗Lr；瘤内注射AMP，而非VAN，可减少瘤内Lr。与瘤内注射VAN的Lr处理小鼠相比，瘤内注射AMP的Lr处理小鼠却无显著的肿瘤抑制或生存率的改善。总之，瘤内Lr的存在是抗肿瘤的充分条件，也是促进抗肿瘤Tc1免疫、抑制肿瘤生长和提高临床前黑色素瘤生存率所必需的（图2）。

图2. 瘤内Lr是介导抗肿瘤作用的必要和充分条件

用Lr分别处理YUMM1.7黑色素瘤、MC38结肠腺癌和MMTV-PyMT乳腺癌的小鼠，均显著抑制肿瘤生长，这表明Lr介导的肿瘤抑制不是黑色素瘤模型所特有的。随后用热杀的Lr进行处理，结果显示，与用活体Lr处理的小鼠相比，口服或瘤内注射热杀的Lr都不足以抑制肿瘤生长或延长生存期，这表明抗肿瘤机制可能依赖于Lr的代谢活性（图3）。

图3. 热杀的Lr不能诱导肿瘤抑制

Lr已被证明能释放几种免疫调节代谢物，其中包括吲哚衍生物I3A，它通过激活芳烃受体（AhR）（一种普遍表达的转录因子）而显示出T细胞免疫调节特性。于是探究Lr释放的I3A是否在Lr诱导的Tc1介导的抗肿瘤免疫中发挥关键作用，使用敲除芳香族氨基酸转氨酶基因（Lr ΔArAT）的转基因菌，其不能将食物中的色氨酸（Trp）分解为I3A。结果发现，与口服Lr WT不同，口服Lr ΔArAT未能抑制肿瘤生长，未能增加存活率也未能引发抗肿瘤Tc1免疫。通过培养用Lr WT或ΔArAT处理的小鼠的肿瘤，结合对肿瘤分离物的菌株特异性PCR，发现两种Lr菌株都存在，并以类似的水平存活，表明Lr ΔArAT是可以转位到肿瘤中的，其未能诱导肿瘤抑制或Tc1扩张的原因并不是其不能转位到肿瘤中。随后在富含Trp的培养基中对肿瘤来源的Lr分离物进行传代培养，结果发现，与Lr ΔArAT和对照组处理的小鼠相比，Lr WT处理的小鼠AhR活性和I3A的丰度显著增加，表明转位的Lr WT而非ΔArAT在体内将Trp分解成AhR配体I3A。

那么只有I3A是否足以诱发抗肿瘤反应呢？结果表明，口服I3A后可抑制肿瘤生长，并以剂量依赖的方式增加生存率，且I3A足以显著提高TME中Tc1的丰度和效应器功能。I3A的瘤内注射也导致显著肿瘤抑制，并以剂量依赖的方式增加存活率，表明I3A可以直接从TME内抑制肿瘤生长。且与单独使用PD-L1相比，I3A和PD-L1的组合治疗导致了肿瘤生长的显著抑制，接受组合治疗的小鼠的肿瘤重量相比对照小鼠显著下降。总之，Lr产生的I3A是抗肿瘤效应必需的，足以促进肿瘤Tc1的免疫，具有增强ICI的作用（图4）。

图4. Lr释放的I3A是促进抗肿瘤免疫的必要条件和充分条件

已报道AhR激活在使CD4 T细胞分化向Th17或Treg细胞谱系倾斜方面发挥关键作用，并以配体依赖的方式进行。通过用来自LrWT或ΔArAT的上清液培养用αCD3和αCD28激活的脾脏新生CD8 T细胞，这两种细胞分别激活和不能激活AhR，观察到Lr WT-而非ΔArAT-衍生的上清液能诱导IFNγ的产生，表明Lr释放的I3A直接作用于CD8 T细胞，促进Tc1功能。转录因子富集分析显示AhR依赖性的基因富集，这些基因含有cAMP反应元件结合蛋白1（Crebp1）的转录因子结合点，其中CREB是关键的1型效应基因（如IFNγ）的重要转录激活因子，在丝氨酸133（Ser133）处进行磷酸化以激活和CREB介导的转录。结果显示，I3A刺激CD8 T细胞导致CREB（pCREB）在丝氨酸133处的磷酸化显著增加，I3A诱导关键的Tc1转录因子Blimp1和Tc1效应基因Ifng显著上调；且I3A以AhR依赖性的方式促进Tc1分化，而AhR拮抗剂则抑制I3A诱导的Tc1命运，且在AhR缺陷的CD8 T细胞中，I3A则不能诱导pCREB以及Tc1转录和T细胞效应。构建CD8 T细胞内AhR特异性缺失的小鼠（Ahr^f/fCD8 Cre⁺），结果显示，在Ahr^f/fCD8 Cre⁺小鼠中，Lr和I3A都不能介导的肿瘤抑制和生存益处，I3A处理未能诱导显著的Tc1反应，揭示了Lr释放的I3A介导的肿瘤抑制依赖于CD8 T细胞内的AhR激活。总之，Lr衍生的I3A以CD8 T细胞内在的、AhR依赖的方式促进Tc1分化和效应功能（图5）。

图5. I3A通过激活CD8 T细胞内的AhR介导抗肿瘤免疫

鉴于Lrc将饮食中的Trp分解成AhR配体I3A，评估饮食中的Trp水平是否影响Lr介导的抗肿瘤反应。在肿瘤细胞植入前4周，将小鼠置于高Trp或低Trp的饮食中，结果显示，与低Trp（0.19%）饮食且接受Lr的小鼠相比，高Trp（1.19%）饮食且接受Lr的小鼠呈现显著肿瘤抑制、生存率增加，表明高Trp的饮食能增强Lr介导的肿瘤抑制。且仅用高Trp的饮食（不用Lr处理）就足以抑制黑色素瘤的生长，并延长小鼠的生存期。此外，单独使用高Trp的饮食以及高Trp和Lr的组合处理的抗肿瘤效果与TME的AhR活性增加显著相关，表明高Trp的饮食通过增加TME内的AhR活性促进抗肿瘤反应。在Lr处理的情况下，高Trp的饮食导致肿瘤内I3A的显著增加。鉴于高Trp饮食的抗肿瘤作用与TME AhR活性的增加相关，评估AhR信号和CD8 T细胞内AhR活性的作用，结果显示，这两者对于Trp饮食介导的肿瘤抑制都需要。此外，单独使用高Trp的饮食显著增强PD-L1的功效。还发现高Trp的饮食足以在复杂的微生物组存在的情况下介导抗肿瘤反应，这表明除了Lr之外，其他分解Trp的细菌也可能有助于抗肿瘤免疫。总之，高Trp饮食能增强Lr的抗肿瘤作用，而在复合微生物群存在的情况下，仅高Trp饮食就能抑制肿瘤的生长并增强ICI（图6）。

图6. 高Trp饮食抑制肿瘤的生长并增强ICI

纳入晚期四期黑色素瘤患者（n = 42）进行靶向代谢检测，以确定其基线I3A血清水平以研究I3A在影响人类黑色素瘤ICI疗效方面的潜在作用。将这些患者分为对IFNα和PD1组合免疫疗法有反应组（n = 19）和无反应组（n = 23）。结果显示，与无反应组相比，ICI有反应组血清中的外源性I3A浓度显著增加。将患者按血清I3A水平高（>70分位数）和低（<30分位数）分层，发现全身I3A高的患者与I3A水平低的患者相比，其无进展生存（PFS）和总生存期明显延长。

由于在晚期黑色素瘤患者中发现了另一个内源性AhR配体——Kyn的血清水平增加，并与不良预后相关，于是评估队列血清中Kyn的水平。结果表明，与I3A不同，ICI有反应组和无反应组的Kyn水平相似，且当患者按血清高Kyn和低Kyn水平分层时，PFS或总生存率无统计学差异；进一步评估Kyn在模型中的影响，发现Kyn的瘤内注射不能抑制黑色素瘤小鼠的肿瘤生长，表明通过激活AhR的肿瘤抑制是配体I3A依赖性的。总之，微生物AhR配体I3A在促进黑色素瘤患者的ICI反应方面发挥着潜在作用，有助于延长PFS和总生存期（图7）。

图7. I3A促进晚期黑色素瘤患者ICI反应和生存

本研究发现益生菌Lr会转移到黑色素瘤内，在黑色素瘤内定植并持续存在，通过释放膳食色氨酸衍生物I3A（芳烃受体激动剂）激活CD8⁺T细胞的AhR通路，促进转录因子CREB磷酸化，促使其产生IFNγ，以增强ICI，抑制肿瘤大小，延长晚期黑色素瘤患者生存期，改善其预后。证实高色氨酸饮食可增强Lr和ICI诱导的抗肿瘤免疫。最后，在临床上验证了I3A促进晚期黑色素瘤患者ICI治疗反应和生存。本研究为临床试验中测试I3A治疗或益生菌和饮食结合疗法改善肿瘤免疫治疗效果提供理论依据。

参考文献

Dietary tryptophan metabolite released by intratumoral Lactobacillus reuteri facilitates immune checkpoint inhibitor treatment. Cell. 2023.

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