Cell Metabolism | 肠癌免疫治疗疗效差，氨积累惹的祸！

目前免疫检查点抑制疗法 (Immune checkpoint blockade, ICB)已在实体肿瘤治疗方面取得了临床突破，然而，在绝大多数的CRC中，ICB是无效的。已报道APC、KRAS和TP53基因突变在CRC中更为常见，因此研究团队在特异性靶向结肠上皮的他莫昔芬诱导CDX2-CreERT2小鼠中分别构建了单基因（Apc，SingleMut）、双基因（Apc和Tp53，DoubleMut）和三基因（Apc、Tp53和Kras G12D，TripleMut）突变模型。这些小鼠每天服用50毫克/千克的他莫昔芬（图1A、1B），随后评估总生存率。与预期一致，增加他莫昔芬的剂量导致存活时间逐渐缩短。且在同等的他莫昔芬剂量下，TripleMut的平均存活时间比DoubleMut短约50%。此外，与SingleMut或DoubleMut相比，TripleMut的肿瘤数量增加，组织学上的肿瘤更晚期（图1C-1E）。TripleMut，而非SingleMut和DoubleMut，诱导小鼠出现了肺和肝转移（图1F）。评估每个小鼠模型对抗细胞程序性死亡-配体1（PD-L1）的反应表明，SingleMut和DoubleMut在抗PD-L1治疗后表现出生存期的增加；而与同型对照相比，TripleMut未显示出抗PD-L1治疗后生存率的改善（图1G）。TripleMut小鼠模型中使用另一免疫疗法（IL-17骨髓敲除）也表明，TripleMut小鼠模型对移植IL-17中断的免疫细胞无反应，TripleMut模型对免疫治疗具有耐药性。

图1. 结肠癌原位转移小鼠模型对免疫治疗具有耐药性

肿瘤结肠上皮的RNA测序显示每个模型的基因表达谱呈现显著差异。主成分分析表明，TripleMut小鼠与SingleMut和DoubleMut小鼠沿着PC1显著分离（图2A和2B）。基因集富集分析显示，与DoubleMut相比，TripleMut小鼠的适应性免疫反应或T细胞功能相关通路显著下调（图2C）。对另一组小鼠进行质谱流式细胞技术检测（CyToF）（图2D）显示，TripleMut小鼠的CD44⁺/CD45^-细胞增加，表明该小鼠模型中的癌症干细胞比例增加（图2E）。且TripleMut小鼠模型CD45⁺细胞和CD3⁺细胞的显著减少（图2E）。TripleMut小鼠模型中表达抑制性受体CTLA-4和PD-1的CD4⁺和CD8⁺阳性T细胞显著增加（图2F）。总之，TripleMut小鼠的整体T细胞较少，T细胞功能障碍程度增加。

图2. T细胞在TripleMut小鼠中减少

为了确定对DoubleMut和TripleMut小鼠之间的差异性表达至关重要的上游调控因子，对RNA测序实验中DoubleMut和TripleMut之间差异性表达的基因进行CHIP-SEQ转录因子富集分析，并利用基因/蛋白相互作用分析工具（STRING）聚焦到与KRAS有关联的转录因子：GFI、HNF4a、RUNX1和IRF蛋白家族（图3A）。其中，肝细胞核因子4a（HNF4a）是尿素循环的主要调控因子，是清除细胞氨的必要条件。之前报道的氨相关基因特征，包括鸟氨酸转氨酶（OTC）、氨基甲酰磷酸合成酶-1（CPS1）、HNF4a、ARG1（精氨酸酶）、精氨酸琥珀酸合成酶1（ASS1）和精氨酸琥珀酸酯酶（ASL）的低表达；以及溶质载体家族4成员11（SLC4A11）、谷氨酸酶（GLS）和谷氨酸脱氢酶-1（GLUD1）的高表达，在TripleMut小鼠呈现显著不同（图3B和3C）。代谢组学的PCA分析表明，SingleMut、DoubleMut和TripleMut组别之间呈现显著分离。TripleMut中嘧啶代谢的显著下调，嘧啶代谢失调是尿素循环功能障碍的一个核心特征。与正常结肠组织相比，在CRC中HNF4a和OTC显著下调（图3D）。这些发现也在另一CRC患者队列中得到证实（图3E）。此外，对SingleMut、DoubleMut和TripleMut小鼠模型解剖的肿瘤上皮和基质区的流动分析表明，Otc和Hnf4a在肿瘤上皮中显著降低（图3F）。在癌症模型中，由于Hnf4a、Otc和其他与氨相关的基因的下调以及这些代谢物的代谢转变，接下来利用Nessler试剂（一种可以检测组织中游离氨的染色剂）评估CRC中的氨积累。对DoubleMut和TripleMut结肠的检测表明，与DoubleMut相比，TripleMut小鼠的上皮细胞氨染色显著增加（图3G和3H）。在另一独立小鼠队列中使用质谱检测，结果表明TripleMut小鼠的氨显著增加（图3I）。在三种胃肠道癌（结肠癌、胃癌和肝癌）中，氨相关的基因特征与生存率下降有关（图3J）。以上结果表明：（1）小鼠和人类CRC中氨代谢失调导致瘤内氨积累；（2）与氨相关的基因表达可对CRC患者进行预后分级。

图3. 在晚期结直肠癌中氨代谢失调

接下来探究微环境中氨积累如何改变CRC细胞系和初级免疫细胞的生长。与之前在乳腺癌细胞系中的报道一致，氨增加显著改变CRC细胞系的细胞生长（图4A），且原代肝细胞在处理后24小时内可以有效清除氨，而MC38 CRC癌细胞系在处理后没有积累氨。这与癌细胞迅速利用氨作为氮源来支持生长一致。剂量反应研究表明，CD4⁺和CD8⁺T细胞的增殖显著减弱（图4B），T细胞激活标志物CD25的表达减少（图4C），氨处理后细胞死亡显著增加（图4D）。此外，在体外用氨处理的人类T细胞的增殖显著减少（图4E）。与TripleMut小鼠类似，氨处理导致衰竭型T细胞标志物（PD1⁺TIM3⁺）增加，T细胞中干扰素γ（IFNg）的产生减少（图4F）。用氨处理的T细胞中GLUD增加。为了证实氨促使TME衰竭，分析氨处理后程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）的基因表达（图4G），与小鼠的数据一致，氨显著诱导了人类T细胞中PD-1的表达，而非CTLA-4（图4H）。为了确定小鼠全身氨水平的增加是否会改变T细胞的功能，将小鼠置于乙酸铵饮食中，7天后，血清氨水平增加（图4I）。从服用乙酸铵饮食的小鼠中分离出的T细胞显示出增殖的减少以及PD-1和CTLA-4表达的增加，这支持了高浓度氨促使T细胞衰竭（图4J和4K）。且用氨处理的T细胞12小时，然后用新鲜培养基补充72小时，T细胞生长持续下降。为了证实氨对T细胞的长期影响，用乙酸铵或正常饲料处理小鼠，然后分离出CD8⁺T细胞，并在体外激活后将这些细胞转移到MC38肿瘤小鼠体内（图4L），结果表明，来自对照组小鼠的活化CD8⁺T细胞能够减少肿瘤的生长，但从食用乙酸铵的小鼠中分离出的T细胞并没有抑制肿瘤的生长（图4M）。这表明氨诱发T细胞衰竭。为了探究氨是否能驱动肿瘤的发生并改变肿瘤T细胞的反应，给SingleMut小鼠模型喂食乙酸铵饮食。与未经处理的SingleMut小鼠相比，服用乙酸铵的SingleMut小鼠体重下降，存活率降低，结肠变短，CD4⁺和CD8⁺T细胞的比例下降（图4N和4O）。这表明，氨处理可持久地减少T细胞的增殖和激活，并有加速肿瘤进展。

图4. 氨积累减少T细胞的增殖和激活

为了确定氨改变T细胞功能的机制，进行了靶向代谢组学研究。从野生型小鼠中分离出来并在体外用氨处理的T细胞，以及从乙酸铵处理的小鼠中分离出来的T细胞，PC1上呈现聚集，表明有类似的代谢反应（图5A）。氨基酸、尿素循环和烟酰胺代谢物在两种处理模式中是最丰富和最常见的（图5B和5C）。且甲硫氨酸代谢通路发生显著改变（图5C）。由于氨处理后谷胱甘肽显著减少（图5D），因此评估了从[³⁵S]-甲硫氨酸到谷胱甘肽的放射性标记通量分析。氨处理后，[³⁵S]-甲硫氨酸并入谷胱甘肽的程度显著下降（图5E）。此外，氨处理减少了¹³C₅-甲硫氨酸到标记的S-腺苷甲硫氨酸的转化（图5F）。用胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）抑制剂炔丙基甘氨酸和CBS抑制剂CH004共同处理T细胞，以检查对甲硫氨酸代谢的抑制是否对T细胞有毒性。CSE/CBS抑制剂的处理减少了T细胞的激活、细胞因子的产生和细胞增殖（图5G-5I）。且N-乙酰半胱氨酸（NAC）和细胞可渗透的谷胱甘肽乙酯（GEE）逆转了氨对T细胞增殖的影响（图5J）。在体外和体内用氨处理后，CD4⁺和CD8⁺T细胞的活性氧（ROS）和脂质ROS显著增加（图5K、5L），但在CRC细胞系中没有（图5M）。此外，铁死亡抑制剂ferrostatin可以挽救氨对T细胞生长的抑制（图5N）。总之，高浓度的氨通过甲硫氨酸代谢的失调诱导T细胞的氧化应激。

图5. 氨积累导致甲硫氨酸代谢失调和T细胞氧化应激

临床上，鸟氨酸被用于高氨血症患者，通过刺激尿素循环和谷氨酰胺的合成来消除氨。它激活氨基甲酰-磷酸合成酶并驱动尿素循环。按照临床相关剂量对乙酸铵饲养的小鼠进行鸟氨酸腹腔注射，可以降低血清氨水平，增加T细胞增殖（图6A和6B）。鸟氨酸处理导致MC38和CT26共生体肿瘤生长显著减少（图6C、6D）。肿瘤生长的减少取决于T细胞，因为鸟氨酸没有改变植入小鼠的MC38和CT26肿瘤的生长，也没有改变CD8耗竭后的生长（图6E）。肿瘤生长的减少伴随着Ki67（图6F、6G）和肿瘤氨水平（图6H）的显著降低。进一步发现，鸟氨酸减少了CD44⁺肿瘤干细胞，增加了MC38肿瘤的CD4⁺和CD8⁺T细胞。对CRC患者和健康对照组的血清氨水平进行了评估显示，与健康对照组相比，CRC患者的血清氨水平显著增加。在转移性CRC中血清氨进一步增加（图6I）。利用以前建立的同步肝转移小鼠模型，Otc和Hnf4a的表达在肝转移的小鼠中显著减少，氨水平增加（图6J和6K）。每天用鸟氨酸处理的小鼠的肿瘤体积减小，并保持更正常的肝脏（图6L和6M）。肿瘤大小的减少伴随着氨水平的降低，证实了其对氨的解毒作用（图6N）。

图6. 氨清除可以抑制CRC的生长

鸟氨酸治疗可以挽救的CRC小鼠模型中氨驱动的T细胞功能缺陷。接下来评估了鸟氨酸是否能提高抗PD-L1免疫疗法在CRC中的疗效。对TripleMut小鼠注射50mg/kg他莫昔芬，并立即用鸟氨酸或空白对照处理，同时用抗PD-L1或对照物处理。单独使用抗PD-L1或鸟氨酸并不能改善小鼠的生存。然而，鸟氨酸和抗PD-L1联合治疗导致存活率的显著增加（图7A）。PD-L1和鸟氨酸共同处理导致T细胞耗竭的显著减少和整体T细胞浸润的增加（图7B、7C）。且在OTC低表达的肿瘤中，细胞毒性T淋巴细胞的存在不再能预测生存率（图7D）。此外，在一个合并癌症类型的临床大队列中，与高氨水平相关的基因得分预测ICB治疗后的生存率较差（图7E）。同时，评估另一机构接受免疫治疗CRC患者的队列，免疫组化（IHC）结果显示，OTC染色低的患者（与高氨含量有关）在PD-1治疗后的生存率更差（图7F和7G）。总之，在CRC晚期，OTC和HNF4a被下调，导致氨积累，T细胞的甲硫氨酸代谢失调，T细胞衰竭增加，从而导致ICB耐药（图7H）。氨清除能够重新激活T细胞，可以作为提高ICB在CRC中的有效性的新方法。

图7. 氨清除可以重新激活免疫治疗

本研究通过采用CRC自体转移小鼠模型，并使用多组学分析揭示氨代谢相关途径异常导致其在肿瘤微环境的大量积累。高浓度的氨诱导T细胞代谢重编程，增加衰竭，并减少增殖。癌症患者的血清氨增加，氨相关的基因特征与T细胞反应的改变、患者的不良后果以及对免疫检查点阻断的缺乏反应有关。使用高血氨症治疗药物——L-鸟氨酸来加强氨的清除，可以重新激活T细胞，减少肿瘤的生长，并延长生存期，并且增强了抗PD-L1的疗效。总之，该研究明确了加强氨的清除可作为提高免疫治疗疗效的新方法。

参考文献

Microenvironmental ammonia enhances T cell exhaustion in colorectal cancer. Cell Metabolism. 2023.

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