Cancer Cell | 花生四烯酸与IFNγ协同诱导肿瘤铁死亡的新机制

已有研究发现，T细胞衍生的IFNγ可以在体外条件下增强铁死亡诱导剂Erastin或RSL3诱导肿瘤细胞铁死亡的能力，但单一IFNγ并不会诱导肿瘤细胞铁死亡²，同时研究发现脂肪酸代谢可调节细胞铁死亡³。作者提出“IFNγ在没有合成诱导剂的情况下可与选择性脂肪酸协同诱导肿瘤细胞铁死亡”的假设。为了验证这一假设，研究团队在小鼠及人肿瘤细胞系中筛选和测试了所有典型脂肪酸联合或不联合IFNγ的诱导细胞死亡的能力，发现仅有花生四烯酸（Arachidonic acid，AA）联合IFNγ可以诱导Yumm5.2、B16F10和A375三种细胞系的细胞死亡，AA可促进肿瘤脂质的活性氧（ROS）产生，以一种剂量和时间依赖的方式促进细胞死亡。

研究团队进一步验证AA联合IFNγ诱导的肿瘤细胞死亡是不是通过铁死亡的方式。通过在AA联合IFNγ的条件下加入不同的细胞死亡抑制剂，发现仅有添加Ferrostain-1（铁死亡抑制剂）可以逆转AA联合IFNγ的作用，表明AA联合IFNγ通过铁死亡的方式诱导肿瘤细胞死亡。已有研究发现肿瘤抗原特异性的CD8⁺T细胞可以通过IFNγ促进肿瘤细胞的铁死亡2，推测AA是否也可以改变抗原特异性CD8⁺T细胞介导的肿瘤杀伤。研究团队在体外共孵育了表达卵清蛋白（OVA）的肿瘤细胞与OVA特异性的CD8⁺T细胞（OTI），发现添加AA可以增强OTI的肿瘤杀伤能力，同时可以被Ferrostain-1恢复，表明AA与IFNγ可以协同诱导肿瘤细胞铁死亡。

酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员4(ACSL4)主要活化AA生成AA-CoA并酯化成磷脂，已知外源性AA可以通过ACSL4增强RSL3诱导的细胞铁死亡⁴，推测ACSL4可能是AA协同IFNγ诱导细胞铁死亡的关键酶。为论证猜想，研究团队构建了Acsl4敲除的Yumm5.2和MC38细胞系，发现该细胞系可以抵抗RSL3诱导的铁死亡，同时Acsl4的敲除可以消除AA协同IFNγ诱导的细胞铁死亡和脂质ROS产生及不再增强OTI的肿瘤杀伤能力。

研究团队又进行Acls4恢复实验，考虑到结构性强制表达ACSL4可能直接导致肿瘤细胞的死亡，使用强力霉素（doxycycline，Dox）诱导来调节Acsl4^-/-敲除细胞系再表达ACSL4，发现ACSL4的再表达可以恢复AA协同IFNγ介导的功能。研究团队还发现，补充AA可以增强激活的CD8⁺T细胞介导的肿瘤杀伤和脂质ROS产生，而这一作用可以被抗IFNγ单克隆抗体消除。同时，AA不仅可以从日常膳食中获取，还可以通过必需脂肪酸亚油酸衍生，研究团队检测了小鼠外周血和肿瘤组织中AA的含量。综上发现揭示了肿瘤微环境中花生四烯酸和激活的CD8⁺T细胞衍生的IFNγ可通过ACSL4诱导肿瘤细胞铁死亡。

研究团队推测IFNγ可能调节ACSL4在肿瘤细胞中的表达，为了验证这一猜想，将IFNγ与Yumm5.2和MC38细胞系共孵育不同时间，并从mRNA和蛋白水平验证IFNγ增强ACSL4表达的时间依赖性。IFNγ信号通路通过Janus激酶(JAK)信号传感器和转录激活因子1 (STAT1)通路调控基因表达，利用CRISPR-Cas9技术构建了Stat1敲除（Stat1^-/-）的Yumm5.2细胞系，再用IFNγ处理该细胞系则不能刺激Stat1的转录及STAT1和干扰素调节因子1（IRF1）的蛋白表达。研究团队利用Stat1^-/- Yumm5.2细胞系进行了相同的实验，发现在IFNγ刺激下Acsl4在mRNA和蛋白水平表达没有明显变化。有趣的是，AA联合IFNγ刺激Stat1^-/- Yumm5.2细胞系，与野生型相比不能诱导肿瘤细胞铁死亡和脂质ROS产生。研究团队深入探究其分子机制，因为IFNγ激活JAK/STAT1通路后IRF1会结合到干扰素激活反应元件（ISRE)进一步激活相关反应基因的转录，所以研究利用ENCODE染色质免疫共沉淀(ChIP)-seq数据库发现在ACSL4而并非STAT1的启动子区域存在5个潜在的IRF1结合位点（BS1-5），Chip实验提示在A375细胞系中BS2和BS3是IRF1的主要结合位点。综上表明ACSL4是一个未知的IFNγ响应基因，同时STAT1的激活对ACSL4的表达以及AA联合IFNγ诱导的肿瘤细胞铁死亡至关重要。

细胞脂质组成与脂肪酸代谢调控细胞铁死亡，除了影响ACSL4以外，IFNγ与AA协同作用是否可以改变肿瘤细胞内脂质。不同处理Acls^+/+和Acls^-/- Yumm5.2细胞，并进行靶向的磷脂脂质质谱分析，实验发现IFNγ或AA的单独作用轻微改变Acsl4^+/+ Yumm5.2细胞中不同磷脂种类的相对丰度。而氘代花生四烯酸（AA-d5）更倾向于整合到磷脂酰乙醇胺（PE）和卵磷脂（PC）中，特别是C16:0（棕榈酸, PA）、C16:1、C18:0和C18:1四种，当与IFNγ联合时这种作用会增强。综上表明IFNγ会改变ACSL4的表达和脂质组成从而诱导铁死亡。

与Acls^-/-肿瘤细胞相比，在Acsl4^+/+肿瘤细胞中棕榈油酸 (POA)和油酸 (OA)而非其他16C和18C的脂肪酸可以促进肿瘤细胞的死亡与脂质ROS的产生，同时OA所产生的这种作用可以被Fer1逆转而不能被Z-VAD逆转，说明OA可以促进IFNγ和AA诱导的肿瘤细胞铁死亡。同时发现OA影响含AA酰基链的磷脂组成，尤其增加PE和PC中18:1_20:4-d5的磷脂。综上，IFNγ可以重塑ACSL4相关的磷脂来诱导肿瘤细胞铁死亡，而常见的16C脂肪酸（POA）和18C脂肪酸（OA）参与到这个过程中。

因为Acsl4^+/+肿瘤细胞和Acls^-/-肿瘤细胞对铁性细胞死亡具有不同的敏感性。推测在体内Acsl4^+/+和Acls^-/-肿瘤细胞表现出的不同的T细胞反应，可能是因为两者铁性死亡和潜在肿瘤抗原释放与传播的差异导致的。为了验证猜想，将Acsl4^+/+和Acls^-/-的Yumm5.2肿瘤细胞接种至NSG免疫缺陷小鼠（NOD.SCID γc-deficient）和C57BL/6J免疫缺陷小鼠，发现Acsl4^+/+和Acls^-/-肿瘤细胞在NSG小鼠上表现出相同的进展，而在C57BL/6J小鼠上Acls^-/-比Acsl4^+/+肿瘤细胞进展更快，表现为肿瘤体积、质量更大，生存时间更短，同时脂质ROS的水平也更低，肿瘤微环境中浸润的CD8⁺T、CD4⁺T细胞、IFNγ⁺、TNFα⁺的CD8⁺T和CD4⁺T细胞也更少。用MC38结肠癌肿瘤模型和B16F10皮肤黑色素瘤模型进行相同的实验，得到了一致的研究结论，即肿瘤ACSL4缺陷削弱了抗肿瘤T细胞的反应。综上表明，肿瘤ACSL4可以通过肿瘤铁死亡影响体内自发的抗肿瘤免疫。

基于IFNγ是影响免疫检查点抑制剂（ICB）诱导免疫反应的关键，鉴于IFNγ与AA协同诱导肿瘤细胞铁死亡。补充AA作为ACSL4 的底物, 可以在体内诱导肿瘤细胞铁死亡进而抑制肿瘤进展，并协同PD-L1阻断剂在免疫正常的小鼠中的抗肿瘤作用。为了验证猜想，研究团队在C57小鼠身上接种了ICB治疗敏感性从高到低的三种肿瘤细胞系MC38、Yumm5.5和LLC，并给小鼠补充AA、抗PD-L1治疗及联合治疗。发现补充AA与抗PD-L1治疗相似可以减缓MC38及Yumm5.2肿瘤生长，而联合AA和PD-L1 阻断剂治疗可以产生额外的肿瘤抑制作用,同时联合治疗增加了肿瘤微环境中IFNγ⁺、TNFα⁺和颗粒酶B⁺的CD8⁺T细胞的浸润。研究团队在ICB治疗耐受的LLC细胞系中也进行干预，有趣的是补充AA也可以发挥抗肿瘤作用，同时肿瘤微环境中浸润的IFNγ⁺、TNFα⁺和颗粒酶B⁺的CD8⁺T细胞数量也增多。可见，低剂量花生四烯酸靶向肿瘤，促进肿瘤免疫，并使治疗效果对检查点阻断敏感。作者进一步探究AA介导的抗肿瘤作用是否依赖于肿瘤ACSL4和IFNγ信号通路。研究团队在C57小鼠身上接种wild type、Acls^-/-和Stat1^-/-的Yumm5.2肿瘤细胞并补充AA，结果表明AA治疗可以在wild type中表现抗肿瘤作用而不能在另外两种中体现，表明AA介导的抗肿瘤作用依赖于肿瘤ACSL4和IFNγ信号通路。

最后期望研究结果能进一步在人体免疫上得到验证，作者对癌症基因组图谱（TCGA）数据库中癌症患者的基因表达谱和Kaplan-Meier生存分析，发现在黑色素瘤患者和膀胱癌患者中ACSL4高表达与总生存期提高相关，ACSL4表达与CD8A、IFNγ及T细胞标志物正向相关。最后使用肿瘤免疫功能障碍和排除（TIDE算法）评估肿瘤ACSL4表达与免疫治疗临床反应的关系，发现接受免疫治疗的患者中高ACSL4表达与总生存期和无进展生存期增加相关。表明ACSL4可能参与了肿瘤患者自发的或ICB诱导的抗肿瘤免疫。

本研究发现CD8⁺T细胞衍生的IFNγ可以通过JAK/STAT1信号通路调节肿瘤ACSL4的表达，通过ACSL4影响以花生四烯酸为底物，棕榈油酸和油酸参与的脂质合成，从而促进肿瘤细胞的铁死亡。同时补充花生四烯酸不仅可以刺激肿瘤铁死亡，还可以协同增强免疫检查点(ICB)诱导的抗肿瘤免疫治疗。临床上，肿瘤ACSL4与T细胞特征相关，并改善ICB治疗的癌症患者的生存。因此，IFNγ信号通路与选择性脂肪酸配对是一种天然的肿瘤铁死亡促进机制，也是CD8⁺T的一种作用方式。因此靶向花生四烯酸代谢或将是协同阻断肿瘤免疫检查点的新思路。

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