客户案例 | IF 19.87：胞外酸中毒限制T细胞一碳代谢以保护其细胞干性

2023-04-23 13:19:35, 麦特绘谱麦特绘谱生物科技(上海)有限公司

以低pH、缺氧、葡萄糖剥夺和乳酸富集为特征的免疫抑制肿瘤微环境（TME）是阻碍T细胞正常扩增、分化和功能的关键屏障。先前的研究表明TME施加的代谢应激会损害线粒体能力和健康，引发肿瘤T细胞代谢功能障碍；升高的细胞外酸中毒（↑[H⁺]）抑制体内外T细胞的细胞溶解活性。然而，↑[H⁺]对T细胞干性和代谢适应性的影响在很大程度上仍然未知。

2023年01月30日，中国医学科学院系统医学研究院/苏州系统医学研究所李贵登、张连军团队，与四川大学华西第二医院陈路团队合作在国际知名期刊Nature Metabolism正式发表了题为“Extracellular acidosis restricts one-carbon metabolism and preserves T cell stemness”的研究成果。该研究发现，长期胞外酸处理T细胞可抑制MYC–SLC7A5–蛋氨酸轴，削弱T细胞对胞外甲硫氨酸的摄取，进而重编程T细胞的一碳代谢及表观遗传，导致记忆相关基因的H3K27me3沉积减少，促进干性基因的转录激活和线粒体代谢适应性，最终维持T细胞的干性特征。（麦特绘谱提供[¹³C₆]葡萄糖、[¹³C₁₆]棕榈酸盐标记的代谢流分析）

酸性环境（[H⁺]）促进CD8⁺T细胞干性

细胞外酸性环境导致干细胞样CD8⁺T细胞（早期记忆和中央记忆细胞）、干样细胞（CCR7⁺CD62L⁺）的比例更高，TCF1表达显著增加，细胞内干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）显著减少。RNA测序发现长期体外[H⁺]导致T细胞转录谱重塑，以建立干细胞——编码效应分子的基因和共抑制受体BTLA的表达显著降低，BACH2、LEF1和TCF7表达显著增加并经qPCR证实。与乳酸钠相比，添加乳酸对T细胞干性效果更明显。

图1. ↑[H⁺]暴露促进干样CD8⁺T细胞的分化

[H⁺]升高触发代谢重编程

富集结果表明，长期[H⁺]暴露的T细胞代谢途径受到影响——长链脂肪酸代谢增加，糖酵解和氨基酸代谢减少；而短期[H⁺]处理仅抑制糖酵解并经qPCR证实。LC-MS非靶向代谢组学结果表明，[H⁺]暴露改变了T细胞中285种产物，尤其是糖酵解中间体和某些必需氨基酸显著减少。[¹³C₆]葡萄糖、[¹³C₁₆]棕榈酸盐标记的代谢流分析（麦特绘谱提供检测）结果表明，[H⁺]暴露阻碍[¹³C₆]葡萄糖融入TCA中间体和乳酸，促进[¹³C₁₆]棕榈酸融入乙酰辅酶A和柠檬酸盐，支持细胞外酸中毒抑制糖酵解并增强T细胞中的FAO的观点。乳酸处理的T细胞GO富集显示，受影响基因涉及PI3K-AKT、mTOR和TCR信号。GSEA分析证实[H⁺]调理的T细胞中AKT-mTOR和NF-кB信号的活性都有所下降。SCENITH评估表明能量密集型蛋白的合成受抑制，表明CD8⁺T细胞的能量代谢发生改变。综合结果，长期的[H⁺]暴露会协调代谢开关，抑制mTOR活性，促进T细胞干性的获得和维持。

图2. ↑[H+]暴露触发代谢重编程并抑制mTOR信号传导

[H⁺]介导的蛋氨酸代谢限制保持了表观遗传的稳定性

RNA-seq分析显示，长期[H⁺]暴露导致T细胞的一碳代谢、蛋氨酸循环、叶酸代谢通路受到抑制；代谢组学同样证明蛋氨酸循环被扰动；¹³C₅标记蛋氨酸代谢流检测显示，[H⁺]暴露的T细胞SAM（S-腺苷甲硫氨酸）、SAH和MTA显著降低。补充外源蛋氨酸可以恢复T细胞蛋氨酸摄取和代谢。蛋氨酸剥夺促进TCF1CD8 T细胞群诱导。补充蛋氨酸或SAM能部分抑制酸中毒诱导的T细胞干性表型。由蛋氨酸转化的SAM是DNA和组蛋白甲基化的重要供体。组蛋白甲基化模式表明[H⁺]主要导致H3K27me3水平降低，补充蛋氨酸后恢复。对应的，H3K27me3的关键甲基转移酶EZH2在mRNA和蛋白质水平上的表达显著降低。[H+]暴露使蛋氨酸转运蛋白（SLC7A5、SLC38A2）、MYC（调控SLC7A5）显著下调；MYC过表达后，SLC7A5和SLC38A2的表达恢复；补充蛋氨酸也可恢复MYC和SLC7A5的表达，表明补充蛋氨酸可能通过MYC依赖性方式上调SLC7A5表达，恢复T细胞的蛋氨酸摄取能力，即MYC–SLC7A5–蛋氨酸轴可能有助于保持TIL（肿瘤浸润性淋巴细胞）的记忆样状态。

图3. [H⁺]的增加改变T细胞蛋氨酸代谢，以保持表观遗传的稳定性

[H⁺]暴露增强线粒体适应性

代谢组学和同位素示踪结果表明[H⁺]暴露导致线粒体代谢增加、糖酵解速率降低；Seahorse分析证实耗氧率（OCR）和SRC（长寿命记忆CD8T细胞的主要特征）都有所增加，而细胞外酸化率（ECAR）降低。[H⁺]处理增强了人和小鼠T细胞的线粒体质量；电子显微镜（EM）表明细胞质中存在大而密集的线粒体，与之融合的几种关键调节因子表达量增加。

图4. [H⁺]暴露增强线粒体适应性

[H⁺]暴露增强CD8T细胞抗肿瘤活性

将CD45.1 OT-I T细胞（对照或[H⁺]处理）转移至小鼠（无或有肿瘤）中，[H⁺]组的小鼠外周血、脾脏和淋巴结（LNs）、肿瘤中的T细胞明显增加，表明经[H⁺]暴露的CD8 T细胞具有更好的持久性。与对照相比，[H⁺]组对肿瘤表现出生长延迟，促进了CAR-T细胞的干性；小鼠肿瘤部位和脾脏中的CAR-T细胞积累率更高，对植入的CD9肿瘤清除率更高，表明[H⁺]处理可促进T细胞的体内持久性和抗肿瘤活性。

图5. 暴露于[H⁺]的T细胞具有更强的抗肿瘤活性

暴露于↑[H⁺]抑制T细胞衰竭

在[H⁺]暴露的T细胞中，LAG-3和TIM-3表达均降低，表明[H⁺]处理可降低T细胞衰竭。高浓度的蛋氨酸导致PD-1、LAG-3和TIM-3等抑制性标记物的表达增加；低浓度蛋氨酸处理则相反。肿瘤内TIM-3、LAG-3浸润的OT-I T细胞（[H⁺]暴露）和CD19-CAR T细胞（[H⁺]暴露）转移后的频率大幅降低。TCF1和TIM-3在CD45.1⁺TILs中的表达模式提示[H⁺]暴露后，TCF1^-TIM-3⁺终耗T细胞的频率大大降低，TCF1⁺TIM-3^-祖T细胞、LY108⁺TIM-3^-祖T细胞、IFN-γ⁺TNF-α⁺T细胞均有所增加，表明长期体外[H⁺]暴露的T细胞限制衰竭并保持干性。

图6. [H⁺]暴露限制T细胞衰竭

小结

肿瘤特异性ACT是治疗难治性肿瘤个体的一种有前途的方法，但其治疗效果在很大程度上受到TME中T细胞功能障碍的限制。本文研究发现长期[H⁺]暴露促使TCF1表达，转录组、非靶向代谢组和代谢流实验表明[H+]暴露改变了转录谱、触发了代谢重编程、改变了表观遗传，T细胞表现出线粒体适应性和干性的获得。机制上，长期的[H⁺]暴露抑制MYC表达，降低T细胞表面甲硫氨酸转运体（SLC7A5）的表达，进而削弱T细胞对胞外甲硫氨酸的摄取，从而抑制S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的产生，SAM引发胞内组蛋白修饰改变，与关键甲基转移酶EZH2（表达降低）一起导致胞内H3K37me3表达降低。CUT&Tag测序发现 [H⁺]诱导的H3K27me3减少促进了T细胞干性相关基因的转录激活，最终维持了T细胞的干性特征，增加了对T细胞衰竭的抵抗力和过继转移T细胞的抗肿瘤作用。综上，该研究发现长期的酸环境能重编程T细胞代谢和表观遗传，从而维持T细胞干性表型；揭示了[H⁺]在T细胞抗肿瘤免疫反应中扮演的新角色，有助于进一步理解酸性肿瘤微环境与T细胞功能分化之间的联系。

参考文献

Extracellular acidosis restricts one-carbon metabolism and preserves T cell stemness. Nature Metabolism. 2023.

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上述研究通过非靶向代谢组、细胞代谢流、转录组测序等方法，研究酸性肿瘤微环境维持T细胞干性、增强抗肿瘤作用及其背后的机制。麦特绘谱在其中提供了代谢流检测服务。代谢流分析（Metabolic Flux Analysis, MFA）技术利用稳定同位素标记特定的化合物，通过分析下游代谢产物的稳定同位素标记模式，推算出该化合物在细胞内代谢通路中的周转速率、方向和分布规律；通过对不同状态的生物体进行代谢流分析，即可得到生物体特定代谢通路的活跃程度，从而在动态水平上描述细胞的代谢活性。麦特绘谱利用GC-MS与LC-MS高互补检测平台，利用13C和15N多标记物示踪覆盖多通道被标记代谢物100+种；同时提供实用超全贴壁和悬浮细胞代谢流收集方案和套餐式/定制化代谢流检测和结果解读一体化服务。

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往期回顾

1. Signal Transduct Tar | 细胞核中存在非经典三羧酸循环连接代谢和表观遗传回路

2. 客户案例 | Sci Transl Med：代谢流技术助力线粒体遗传代谢病发生机制及治疗新策略研究

3. Nature Immunology | CD8+T细胞通过尿素和瓜氨酸循环解氨毒以促进自身记忆发育

4. Science | 不节食不运动科学减肥Tips-限时进食法

麦特绘谱生物科技（上海）有限公司（Metabo-Profile）汇聚了从事代谢组学和转化医学研究近二十年的海内外专家团队，专注于精准医学和健康领域的高端代谢组学技术服务，是一家集科技服务、健康检测及产品研发于一体的国家级高新技术企业、上海市“专精特新”企业，已成为全球代谢组学研究者的优选合作伙伴。公司拥有自建1500+功能性小分子代谢物数据库JiaLib^TM、国际领先的代谢组学分析技术平台和全自动化TMBQ定量数据处理软件、代谢组学数据在线分析平台iMAP。截止到2023年2月，麦特绘谱已为数百家三甲医院、科研院所和企业提供高端代谢组学一站式整体解决方案，协助客户与合作伙伴发表SCI文章240多篇，累计影响因子2300+，包括Science, Cell Metabolism, Immunity, Gut, Signal Transduction and Targeted Therapy, Science Translational Medicine等顶级期刊。