客户案例 | 代谢项目文章五连发！周文教授团队最新成果入选2023年度中国血液学十大研究进展！

多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）是一种常见于中老年人血液系统浆细胞的恶性肿瘤，随着我国人口老龄化不断增长，MM发病率呈明显上升趋势。当前MM重要临床问题是耐药所诱导的复发难治。

中南大学肿瘤研究所周文教授课题组一直致力于该疾病的研究，截止目前已与麦特绘谱合作发表5篇代谢组学研究成果，其中前4篇如下：

① 氮循环菌富集促进MM发病（Microbiome ，2020，麦特绘谱提供非靶向、Q300全定量检测服务）；

② 肠道肺炎克雷伯菌通过在多发性骨髓瘤中合成谷氨酰胺导致MM肺炎（Cancers，2022，麦特绘谱提供Q300全定量检测服务）；

③ 首次通过代谢组学发现患者骨髓微环境中氨基酸代谢失衡，甘氨酸是MM的关键代谢调节剂，提示通过阻断甘氨酸摄取、抑制细胞增殖并增强硼替佐米BTZ的作用（Nature communications ，2022，麦特绘谱提供非靶向、Q300全定量、代谢流检测服务；点此查阅详细解读）；

④丝氨酸通过甲硫氨酸循环抑制巨核细胞形成和血小板减少，调控MM进展的分子机制，发现通过靶向血小板减少症为治疗MM患者提供了潜在的治疗策略（Nature communications， 2023，麦特绘谱提供非靶向、氨基酸、代谢流检测服务；点此查阅详细解读），提示从代谢角度干预氨基酸来源、摄取和分解可为MM治疗提供新思路。

收集28名诊断时患有MM的患者（ADs）、17名复发的MM患者（RMs）和年龄及性别匹配的的20名健康对照组（HC）粪便，进行宏基因组测序，发现MM 患者体内富含特异性弗氏柠檬酸杆菌（C.  freundii），且C. freundii丰度与MM的复发时间呈负相关，C. freundii丰度高的患者平均治疗次数显著增加。表明，C. freundii的丰度与MM复发的可能性有关。

图1. 高丰度的氮循环菌C. freundii与MM复发有关

通过粪菌移植（FMT）实验，将MM患者的粪便移植到MM肿瘤小鼠体内后加速了小鼠MM的发展。用硼替佐米（BTZ）处理小鼠后，移植的肠道菌群减弱了BTZ的抗肿瘤作用。

由于C. freundii是已知的氮循环菌，推测C. freundii在氮代谢中的作用可能与其对MM耐药性有关。同时发现定植组小鼠盲肠内容物和血清中的NH4+浓度均升高，且盲肠和血清NH4+浓度之间显著正相关，C. freundii的丰度与盲肠内容物和血清中的NH4+呈正相关。在移植了MM患者粪便的小鼠体中获得一致结果。结果表明C. freundii介导了NH4+的积累。

图2. C. freundii诱导MM中NH4+的积累

临床发现在MM患者中38% 的患者外周血NH4+水平较高；根据粪便 NH4+的中位浓度将RM样本分为两组（低NH4+和高NH4+），发现高NH4+的RM表现出更晚的骨髓瘤分期（Durie-Salmon，DS）。细胞水平上，将MM细胞系（ARP1和H929）在含有不同浓度的NH4+的培养基中培养，发现0.5 mM NH4+增强MM细胞的增殖；在培养基中添加BTZ，发现NH4+处理降低BTZ对MM细胞的抗肿瘤作用。MM动物模型上，补充NH4Cl显著加速MM小鼠进展。总之，NH4+积累可加速MM的进展并诱导对BTZ的耐药性。

在C. freundii参考基因组中发现了由C. freundii转录的特异性高表达脱氨酶编码基因。构建该基因缺失菌株 并对小鼠进行灌胃发现在动物盲肠内容物和血清中NH4+水平降低。随后用C. freundii野生型和突变型定植小鼠，发现野生菌株促进MM进展，而突变菌抑制MM进展。用BTZ处理后，与野生菌组相比，突变菌组MM缓解，而回补NH4+后，突变菌组MM表型逆转。总之，C. freundii通过表达脱氨酶产生了大量NH4+，肠道中产生的NH4+进入血液循环并最终导致MM细胞对BTZ的耐药性。

图3. C. freundii介导的NH4+合成诱导对BTZ的耐药性

已报道，NH4+的两个转运体分别由NKCC1和NKCC2基因编码，而只有NKCC1（别名 SLC12A2，solute carrier family12，溶质转运蛋白）在ARP1和 H929 MM细胞中表达，其表达水平在NH4Cl处理过程中逐渐升高。且在高SLC12A2 表达的MM患者中预后较差。在SLC12A2敲除的慢病毒以及SLC12A2敲除的MM小鼠模型中，SLC12A2的缺失减少对NH4+的摄取，诱导细胞凋亡，并抑制NH4+对BTZ的抑制作用。

为了探索NH4+被吸收后的代谢命运，通过代谢流技术示踪了用¹⁵NH4Cl培养的ARP1细胞的氮代谢，发现大多数氨基酸在培养12小时后被标记。其中，5种氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸），在30分钟后发生显著改变。随着NH4+浓度增加，ARP1和H929细胞中NEK2蛋白水平逐渐升高。NH4+可与多种氨基酸结合，增强 NEK2的乙酰化，同时减少NEK2泛素化，进而减弱NEK2的降解，诱导MM细胞对BTZ的耐药性。

图4. NH4+通过稳定NEK2诱导对BTZ的耐药性

呋塞米钠（Fus），一种环状利尿剂，Fus能以剂量依赖的方式下调ARP1和H929细胞中SLC12A2的表达，抑制MM细胞对NH4+的摄取，改善MM细胞对BTZ的耐药性。临床上，Fus治疗的MM患者获得了更长的无进展生存期和更高的疗效评分。

通过灌胃进行丁酸梭菌单菌定植，发现其显著抑制C. freundii的生长，从而减少了NH4+的产生，减轻了MM细胞对BTZ的耐药性。

图5. 呋塞米钠抑制NH4+摄取可改善BTZ耐药性

本研究发现复发的MM患者肠道菌群中，氮循环菌C. freundii富集，通过增加血液中的NH4+水平，诱导对BTZ的耐药性。机制上，NH4+通过跨膜通道蛋白SLC12A2进入MM细胞，通过增加乙酰化、减少泛素化稳定NEK2蛋白，促进其耐药性。提示C. freundii和NH4+作为关键的MM复发调节因子，为MM的进展和耐药提供了新的治疗靶点。

[1] Alterations of gut microbiome accelerate multiple myeloma progression by increasing the relative abundances of nitrogen-recycling bacteria. Microbiome. 2020.

[2] Intestinal Klebsiella pneumoniae Contributes to Pneumonia by Synthesizing Glutamine in Multiple Myeloma. Cancers. 2022.

[3] Blocking glycine utilization inhibits multiple myeloma progression by disrupting glutathione balance. Nature Communications. 2022.

[4] Excessive serine from the bone marrow microenvironment impairs megakaryopoiesis and thrombopoiesis in Multiple Myeloma. Nature Communications. 2023.

[5] Targeting gut microbial nitrogen recycling and cellular uptake of ammonium to improve bortezomib resistance in multiple myeloma. Cell Metabolism. 2023.