Signal Transduct Tar | 细胞核中存在非经典三羧酸循环连接代谢和表观遗传回路

特异性核糖高梯度离心被用于从老鼠肝脏、人肝细胞癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF-7中分离细胞核用来全面研究细胞核中TCA循环酶的范围和种类。分离出的细胞核被证实没有受到细胞质和线粒体蛋白的污染，并进行了免疫印迹和免疫荧光染色，以检测分离出的小鼠肝细胞核以及从人类细胞系中分离出的细胞核中与TCA循环相关的酶。值得注意的是，在来自小鼠肝细胞核，HepG2和MCF-7细胞的分离细胞核中均检测到TCA循环相关酶的类似特征（图 1b）。免疫印迹和免疫荧光染色表明，除了琥珀酸脱氢酶 (SDH)之外，所有线粒体TCA循环相关酶（柠檬酸合酶(CS)、乌头酸酶2(ACO2)、异柠檬酸脱氢酶 3(IDH3)、酮戊二酸脱氢酶(OGDH)、琥珀酰辅酶 A 合成酶(SCS)、延胡索酸水合酶(FH)和苹果酸脱氢酶2(MDH2)）也存在于细胞核中，并且这些酶的核信号与组蛋白H3的信号共定位，表明这些酶也存在于细胞核中（图1c&d）。

图1. TCA 循环的酶也存在于细胞核中

酶活性检测试剂盒用于测定细胞核和细胞质中每个TCA循环酶的酶活性。其中柠檬酸合酶、乌头酸酶2、异柠檬酸脱氢酶3、酮戊二酸脱氢酶、琥珀酰辅酶 A 合成酶、延胡索酸水合酶和苹果酸脱氢酶2的酶活性在细胞核和细胞质中都被检测到。这些具有催化活性的TCA循环相关酶的存在表明它们可能独立作用或作为生化系统的一部分类似于线粒体中的TCA循环。为了测试这个假设，研究人员使用液相色谱-质谱分析（LC-MS）在细胞核中检测线粒体TCA循环相关代谢产物。发现多个TCA循环相关代谢中间产物，包括柠檬酸、富马酸、琥珀酸、苹果酸和草酰乙酸，在分离的细胞核中被检测到。接下来，研究人员用草酰乙酸和同位素标记的丙酮酸（¹³C₃-丙酮酸）处理分离的细胞核，并进行了LC-MS分析。他们发现，在核制备中检测到¹³C标记的线粒体TCA循环中间产物，包括柠檬酸、异柠檬酸、α-KG和琥珀酸，这表明一个系统化和类似于TCA循环的生化系统正在细胞核中发挥作用。为了进一步支持这个假设，研究人员孵育分离的HepG2细胞核，其中一部分含有草酰乙酸和乙酰辅酶A，而另一部分则不含。LC-MS分析显示，核中的柠檬酸和异柠檬酸含量增加了，这表明由CS催化的酶促反应处于活跃状态。相反，从CS缺失的HepG2细胞中分离出的核的LC-MS分析显示，柠檬酸和异柠檬酸的含量降低。

图2. 核TCA循环相关酶催化其相应的生化反应

nTCA循环与经典线粒体TCA循环是用于进一步了解nTCA循环的性质。HepG2细胞的免疫荧光染色表明CS、ACO2、IDH3A、OGDH、SUCLG2、FH 和 MDH2在线粒体中的比在细胞核中更加富集。TCA循环酶在线粒体中更丰富，可能是因为该细胞器是主要的代谢中枢和细胞的主要动力室。此外，观察到TCA循环相关酶在细胞核中的丰度较低，这也可能解释了为什么这些酶作为一个整体以前曾逃过检测。那么nTCA循环是如何跳过SDH催化的反应的呢？标记底物和酶缺失细胞实验证明nTCA循环以琥珀酸结束，SDH反应的下游代谢中间体富马酸、苹果酸和草酰乙酸是由类似于蓝藻TCA循环（不完整的TCA循环）的逆反应产生的。因此，与细胞质相比，细胞核中TCA循环酶的丰度通常更高，这可能解释了为什么以前未检测到nTCA循环。此外，nTCA循环似乎主要用于产生代谢中间体，而不是用于能量生产。总的来说，nTCA循环的发现揭示了细胞代谢的复杂性以及不同细胞区域可能存在不同代谢途径的潜力。

图3. nTCA循环是不完整的，并且与线粒体TCA循环不同

接下来，探究非典型TCA循环 (nTCA) 与染色质活动的表观遗传调控之间存在功能联系是基于参与 nTCA循环柠檬酸合酶 (CS)的过表达或敲低，并使用蛋白质印迹分析了对组蛋白乙酰化的影响。该研究表明，核柠檬酸合酶 (CS) 通过调节局部乙酰辅酶A的可用性来影响组蛋白乙酰化。CS的过表达与组蛋白乙酰化水平的降低有关，而CS的敲低导致组蛋白乙酰化水平的增加。

该研究还表明，核CS调节的组蛋白修饰是HAT依赖性的。CS核表达的重建抵消了CS耗竭相关的组蛋白乙酰化增加。这些发现表明nTCA循环和表观遗传调控在功能上是相关的，并且核CS可以通过调节局部乙酰辅酶A的可用性来影响HAT依赖性组蛋白乙酰化。

图4. nTCA循环功能上与表观遗传调控和染色质动态相关联

文章接下来着眼于三羧酸循环在调节表观遗传修饰，特别是组蛋白甲基化和DNA胞嘧啶羟甲基化方面的作用。异柠檬酸脱氢酶3（IDH3）是三羧酸循环的限速酶，并且核内的IDH3A通过产生α-酮戊二酸（α-KG）发挥了调节组蛋白甲基化和DNA胞嘧啶羟甲基化的关键作用，α-KG是许多组蛋白去甲基酶和TET二氧酶所需的辅因子。实验结果表明，IDH3A的过表达或缺乏线粒体定位序列的突变型IDH3A会导致H3K4me3和H3K9me3水平降低，而IDH3A的缺乏则会导致这些组蛋白修饰的增加。此外，IDH3A的缺乏取消了与TET2-CD区过表达相关的5hmC水平的增加，这种影响可以通过表达核内IDH3A突变体来挽救。此外，作者利用ATAC-seq研究了CS或IDH3A缺陷对HepG2细胞染色质可及性的影响。他们发现，CS缺乏导致56,732个总可访问位点中的14,578个可访问位点的可及性增加，而IDH3A缺陷导致51,923个总可访问位点中的9,620个可访问位点的可及性增加。

图5. 核IDH3A调节组蛋白/DNA甲基化

为了研究核柠檬酸合成酶（CS）在调节基因表达和细胞活动中的表达，RNA-seq和ATAC-seq分析被应用于研究中，该研究确定了989个基因，其表达在CS缺失时发生改变，其中很大一部分与细胞通路如凋亡、细胞周期和转化起始相关。进一步的实验表明，核CS对FADD表达的调节源于nTCA循环的功能，并且CS通过调节FADD表达来调节细胞凋亡。这些发现对理解细胞过程和与失调的凋亡相关的疾病的潜在治疗靶点具有重要意义。该研究强调了核CS在调节基因表达和细胞活动中的关键作用，并为代谢和基因调控之间的复杂相互作用提供了新视角。此外，该研究突显了靶向核CS作为治疗凋亡失调相关疾病的治疗策略的潜力。

图6. nTCA循环在功能上与转录调节和细胞活动相关

研究结果发现IDH3A通过参与nTCA循环，在调节基因表达、染色质可及性和细胞增殖方面发挥着关键作用。通过使用RNA-seq分析耗尽IDH3A的HepG2细胞的基因表达谱并将数据与ATAC-seq交叉引用，确定了大量基因的表达在IDH3A耗尽时发生改变，包括许多参与细胞通路的基因，例如细胞周期、细胞凋亡和细胞对缺氧的反应。已鉴定的基因之一是EGFR，它是细胞增殖和发育的关键调节因子，其表达通过nTCA循环由核IDH3A调节。在HepG2细胞中使用IDH3A过表达或消耗的进一步实验表明，细胞核IDH3A通过其对EGFR表达的影响在调节细胞增殖中起着至关重要的作用。核IDH3A过表达诱导了细胞增殖、促进S期的进入和抑制 进入G1期，这些作用都被IDH3A的耗竭所逆转，还可以通过同时过表达核IDH3A或EGFR来挽救。这些结果表明IDH3A通过nTCA循环调节EGFR表达来调节细胞增殖。

图7. 核IDH3A通过调节EGFR表达促进细胞增殖

本论文介绍了细胞核内nTCA循环，这是细胞核中的一种非经典和不完整的TCA循环，它在功能上与染色质动力学和表观遗传调控有关。该研究在细胞核中检测到除SDH之外的所有TCA循环相关酶，证明这些核酶催化的生化反应类似于线粒体中相应酶催化的反应。文章提出，类似于蓝藻中的TCA循环，nTCA循环可以通过SDH下游酶催化的一系列逆反应完成。同时本文还认为nTCA 循环起源于真核生物进化过程中的共生古细菌包涵体。本文重点介绍了染色质的巨大可塑性的机制和意义---表观遗传学的主要驱动力。表观遗传学的本质仍然是与化学或结构修饰相关的现象，导致染色质构型改变。组蛋白的翻译后修饰和 DNA 的复制后修饰是表观遗传调控的标志。这些机制以有序和协调的方式发挥作用，调节转录、DNA复制和DNA修复等细胞核活动，形成一个密切自我强化的相互作用和相互依赖的系统来塑造染色质结构和控制染色质的可塑性，并且这种相互作用的破坏可能有助于癌症等疾病的发展。

The existence of a nonclassical TCA cycle in the nucleus that wires the metabolic-epigenetic circuitry. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2021

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