Nature Immunology | CD8+T细胞通过尿素和瓜氨酸循环解氨毒以促进自身记忆发育

在ATP生成过程中，副产物活性氧（ROS）和氨（NH3）凭借细胞毒性影响细胞寿命。因此，长寿的细胞需要清除ROS和NH3。作为长寿细胞，CD8⁺记忆T（T_M）细胞已被证实可生成NADPH和清除ROS，但CD8⁺T_M细胞解毒氨的方式还不清楚。深入解析CD8⁺T_M细胞NH3解毒机制，有助于改善基于T细胞的癌症免疫疗法。

图1. 记忆T细胞通过氨解毒促进记忆形成的机制

研究人员将CD45.1⁺ OT-I T细胞转移到CD45.2⁺ C57BL/6小鼠身上并用表达卵白质（Lm-OVA）的李斯特菌感染，在第7天和第30天分别用CD45.1⁺CD8⁺进行OVA特异性效应T（T_eff）细胞和T_M细胞分类。基于液质联用的代谢组学检测表明氨基甲酰磷酸盐（CP）、中间产物氨基酸和尿素在T_M细胞中含量丰富；在转移OT-II T细胞和OVA蛋白免疫的小鼠模型中，CD4⁺ T_M细胞也显示出较高的中间代谢物水平。与之一致的是，体外将CD8⁺ OT-I细胞分化为T_M或T_eff细胞后，CP和其他代谢物也高度累积于白细胞介素（IL）-15诱导的TM细胞而不是IL-2刺激的T_eff细胞中。代谢流实验中，¹⁵N标记的NH4Cl体外处理CD8⁺ T_eff和T_M细胞后，CD8⁺T_M细胞（IL-15诱导）中CP（m⁺1）和其余中间物质的相对丰度显著高于CD8⁺T_eff细胞（IL-2诱导）。此外，另一氨内源性供体（谷氨酰胺）的¹⁵N标记代谢流实验得到的结果与NH₄Cl一致。使用谷氨酰胺酶特异性抑制剂BEPTS阻断谷氨酰胺→氨过程，导致CD8⁺T_M细胞尿素循环中的¹⁵N-同位素减少。这些结果表明，CD8⁺T_M细胞中存在活跃的尿素循环。

图2. CD8⁺T_M细胞中存在活跃的尿素循环

与T_eff细胞相比，T_M细胞中的铵较少；CD8⁺T_M细胞而非T_eff细胞对NH₄Cl诱导的细胞死亡表现出抵抗力。T_eff细胞中氧化Bodipy染色和RIP3磷酸化没有改变，caspase-3被诱导裂解，表明细胞凋亡（而非铁死亡或坏死性凋亡）可能参与了死亡过程。尽管NH₄Cl促进自噬，使用3-MA抑制自噬后并不影响NH₄Cl对T细胞死亡的影响，表明自噬对T细胞死亡的影响很小。使用CPS1特异性抑制剂阻断尿素循环或CPS1异生激活剂N-乙酰谷氨酸（NAG）被shRNAs干扰后，伴随TM细胞中的氨含量增加、TM细胞的数量减少，表明α-酮戊二酸和氨由谷氨酸脱氢酶催化，产生谷氨酸用于生产NAG。NAG类似物N-氨基甲酰谷氨酸（NCG）处理CD8⁺T_M细胞后T_M细胞中的氨减少，同时增强对NH₄Cl的抵抗力，T_M细胞的体外形成增多（可被CPS1 shRNA废除）。小鼠经NCG处理后，在淋巴结（LNs）、外周血单核细胞（PBMCs）和脾脏中检测到更高比例Lm-OVA诱导的CD8⁺T_M细胞。CPS1敲除后，小鼠TM细胞的频率受损且不被NCG恢复。此外，初始T细胞中氨和NAG的¹⁵N流量很小。这些结果表明，尿素循环是CD8⁺T细胞记忆发展所必需的。

图3. 尿素循环为CD8⁺T细胞记忆发展所必需

WB结果显示催化尿素循环最后一步的精氨酸酶1（ARG1）并不在 OT-I 或 IL-15 诱导的 TM 细胞表达；而位于肾脏线粒体中的精氨酸同工酶2(ARG2) 在 CD8⁺ T_M细胞中上调，并通过免疫印迹选择性地存在于线粒体中。共聚焦显微镜结果也证实了这一点，提示CD8⁺ T_M细胞可能使用精氨酸酶2催化精氨酸产生尿素。研究人员使用 Arg2 shRNA或抑制剂 nor-NOHA 处理IL-15诱导的T_M 细胞，发现 CD8⁺T_M细胞中氨增加、尿素减少、CD8⁺T_M细胞数量减少；此外与验证结果一致，在 Lm-OVA 感染的小鼠中，nor-NOHA 对 ARG2 活性的抑制导致氨增加、尿素和 OT- I TM 细胞减少。敲低Arg2减少了尿素、鸟氨酸含量，提高了 IL-15 诱导的 TM 细胞中 CP、瓜氨酸、精氨基琥珀酸和精氨酸含量，体内 TM 细胞形成受损。这些结果证实 CD8⁺T_M细胞动员线粒体ARG2催化精氨酸以产生尿素。

图4. CD8⁺T_M细胞动员ARG2以产生尿素

胞质溶胶是尿素循环产生精氨酸的场所，SLC25A29介导精氨酸从胞质溶胶转运到线粒体中。与T_eff细胞相比，SLC25A29 mRNA 在T_M细胞中增加了四倍；免疫印迹和免疫荧光染色显示 该基因定位于T_M细胞的线粒体膜。敲低 SLC25A29会减少尿素和鸟氨酸含量，增加瓜氨酸、精氨琥珀酸和精氨酸水平，阻碍了 IL-15 诱导的 CD8⁺T_M细胞形成；添加SLC25A29抑制剂吡哆醛5-磷酸一水合物也可获得类似结果。

在线粒体中，精氨酸衍生的尿素可由SLC14A1运输，从线粒体转运到胞质溶胶，最后释放到胞外。与T_eff细胞相比，SLC14A1的表达在CD8⁺T_M细胞中上调；免疫荧光染色表明 SLC14A1 在 CD8⁺T_M细胞的线粒体中高表达。敲除 SLC14A1使CD8⁺T_M细胞形成减少，增加 CD8⁺T_M细胞中线粒体尿素。这些结果表明SLC25A29和 SLC14A1 在CD8⁺T_M细胞中分别负责将精氨酸输入、将尿素输出线粒体。

图5. SLC25A29和SLC14A1推动尿素循环

除了被精氨酸酶利用，精氨酸还可被NOS催化生成NO和瓜氨酸并沿尿素循环途径再次产生精氨酸（瓜氨酸循环）。研究人员释放CD8⁺T_M细胞产生的 NO，发现TM细胞（而非T_eff或Tn）中产生大量的 NO和较高的NOS 活性。添加细胞 NO 产生抑制剂（L-NMMA26）导致氨水平升高并抑制 CD8⁺T_M 细胞诱导，NO产生受到抑制，表明瓜氨酸循环 参与氨的处理，是CD8⁺T细胞记忆发育所必需的。与 T_eff细胞相比，eNOS（内皮型）、nNOS（神经元型）和 iNOS（诱导型）在 CD8⁺T_M细胞中的水平显著更高且 iNOS 最高。使用选择性抑制剂（N-（3-（氨基甲基）苄基）乙脒 (1400W)、L-NAME（10μM 低剂量）和亚精胺抑制酶活后，研究人员发现添加 1400W 、L-NAME 的效果明显强于亚精胺——氨增加、 NO 减少和 CD8⁺T_M形成受损；NOS shRNA 实验结果与之一致。因此，iNOS 和 eNOS 可被 CD8⁺T_M细胞用于处理精氨酸氮。联合使用ARG2和NOS抑制剂处理IL-15诱导的CD8⁺T 细胞后记忆形成几乎完全被阻断，并伴随着尿素生成中断。¹⁵N-精氨酸追踪氮代谢流结果表明尿素循环和瓜氨酸循环可分别通过m+2鸟氨酸和m+3瓜氨酸表征，约40%的精氨酸被 ARG2 分解代谢，60% 被 NOS 分解代谢（可被 ARG2 抑制剂 nor-NOHA 或 NOS 抑制剂 L-NMMA 阻断）这些结果表明瓜氨酸循环与 CD8⁺T_M细胞中的氮处理是互补的。

图6. CD8⁺T_M细胞通过瓜氨酸循环处理氨

将shCPS1 OT-I CD45.1⁺T细胞转移到CD45.2⁺小鼠体内，与转移shNC（阴性对照）OT-I T细胞相比，Lm-OVA感染导致LNs、PBMCs和脾脏中CD8⁺T_M细胞（而非T_eff细胞）数量减少。相反，OT-I T细胞中过表达CPS1导致TM细胞数量增多，氨产生减少，尿素循环中间产物增加；并在15N-NH4Cl的代谢追踪得到证实。ki67表达和5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记结果表明shCPS1不影响细胞增殖；Annexin V⁺ OT-I细胞增加表明CPS1的氨清除促进CD8⁺T_M细胞的生存；研究人员构建过表达和沉默载体并转移到小鼠体内，验证了shCPS1和OE-CPS1对CD8⁺T_M细胞的减少和增加作用。研究人员将细胞分选后注入小鼠体内，发现30天后shCPS1组T_M细胞数量减少而OE-CPS1组增加，表明CPS1的调节可能是触发氮处理的一个关键分子事件。此外，研究人员采用GFP-shNC或GFP-shCPS1 OT-I细胞移植至小鼠并进行Lm-OVA感染，发现shCPS1并不改变IL-2、干扰素（IFN）-γ、肿瘤坏死因子（TNF）-α和颗粒酶B的产生并在GFP-OE-CPS1转移的小鼠上得到验证。然而，5天后重新实验导致T_eff细胞数量减少（shCPS1组）或增加（OE-CPS1组），表明CPS1可能不影响早期召回，但对后期Teff细胞数量有影响。

图7. CPS1对于氮处理和记忆发展至关重要

ChIP-qPCR分析表明更高水平的H3K9bhb与 CD8⁺T_M（IL-15衍生）细胞中的CPS1位点结合。同时， β-羟基丁酸 (BHB)增强了CPS1基因座上的 H3K9bhb 修饰及CPS1表达；Bdh1（BHB合成基因）的敲低致CPS1表达下调，添加BHB后可恢复，表明CPS1表达受 H3K9bhb调控。与T_eff细胞相比，在 T_M细胞中发现P300（组蛋白羟丁基化的写入器）与H3K9bhb结合更多。P300抑制剂 （A485）致BHB处理的CD8⁺T_M细胞中 H3K9bhb 和CPS1下调；而SIRT3抑制剂3-TYP或HDAC1 抑制剂TSA则相反并损害T_M细胞形成，研究人员认为P300、SIRT3和HDAC1参与了CPS1表达的调控，p300 可能使用 β-羟基丁酰辅酶 A 作为辅助因子，以产生用于CPS1表达的赖氨酸 β-羟基丁酰化。将修饰的OT-I细胞转移到小鼠后用 Lm-OVA攻击，并在 30 天后接种OVA-B16黑色素瘤细胞，结果表明CPS1缺陷促进了黑色素瘤生长并缩短小鼠存活率；过表达CPS1具有改善效果。研究人员将Lm-OVA攻击小鼠的shCPS1或OE-CPS1 OT-I T_M 细胞转移到小鼠后皮下接种OVA-B16细胞，发现CPS1敲低或过表达降低或增强T_M细胞的抗肿瘤作用。综合上述数据，研究人员提出Kbhb对CPS1表达的表观遗传调控触发了尿素和瓜氨酸循环，从而触发了 CD8⁺T细胞记忆发育的氮处理。

图8. CPS1的β-羟基丁酰化触发了CP代谢级联

肝外细胞通过转氨作用很难完全清除细胞内氨，残留的氨会危及细胞完整性，尤其是对于长寿细胞而言。因此，这些细胞类型可能存在直接解毒氨的方法。研究人员使用氮代谢流、基于液质的靶向定量代谢组、流式细胞、免疫印迹等方法，证实CD8⁺ T_M细胞使用尿素循环和瓜氨酸循环来解毒氨；与肝细胞一样，所有氨解毒的酶都存在于TM细胞中，而不是初生T细胞或T_eff细胞中。在此前ARG2的作用一致认为不是解毒氨，该研究证实CD8⁺T_M细胞上调线粒体转运蛋白SLC25A29介导细胞溶质精氨酸进入线粒体并被ARG2转化为鸟氨酸和尿素，经线粒体SLC14A1转运蛋白将尿素输送到胞质溶胶；这一过程不仅涉及尿素循环，同时也包括瓜氨酸循环。总之，研究团队的工作揭示了CD8⁺T_M细胞通过促进尿素和瓜氨酸循环解氨毒以维持自身长寿。

Ammonia detoxification promotes CD8⁺T cell memory development by urea and citrulline cycles. Nat Immunol. 2022.

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