项目文章｜代谢组学在医学材料中的大作为：基于磁性纳米颗粒交联GelMA的可调刚度水凝胶软骨再生平台及其内在生物机制

●期刊：Bioactive Materials

●发表时间：2022-07-30

●影响因子：16.874

研究背景

软骨损伤累及众多人群，如何有效修复受损软骨目前面临的最大难题。作为有效的组织再生支架候选材料的水凝胶，一直是目前的研究热点。但是弄清软骨细胞与机械强度的相互作用，提高其力学性能仍然是一个很大的挑战。针对这一问题，四川大学华西口腔医院，口腔研究国家重点实验室副教授谢静老师团队以甲基丙烯酸明胶(GelMA)和氧化铁纳米颗粒(Fe2O3)为材料，通过化学键合制备了一种刚度可调的新型杂化水凝胶。通过调节磁性纳米颗粒的浓度控制Fe2O3/GelMA杂化水凝胶的机械强度，通过调节水凝胶平台的机械强度可调节细胞形态、微丝和软骨细胞的杨氏模量等细胞特性。有趣的是，Fe2O3/GelMA杂交水凝胶促进了线粒体的氧化磷酸化，并促进了软骨细胞中脂质的分解代谢。此外，通过将Fe2O3/GelMA混合水凝胶植入软骨缺损大鼠模型，也验证了其具有缺损软骨修复的潜力。本研究为深入了解Fe2O3/ GelMA混合水凝胶与软骨细胞相互作用的生物机制提供了依据，并为水凝胶平台进一步在组织工程中的应用提供了重要的依据。迈维代谢为本研究提供非靶向代谢组检测服务

实验结果

以甲基丙烯酸明胶(GelMA)和氧化铁纳米颗粒(Fe₂O₃)为原料，通过碳碳双键的化学键合，设计并制备了Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶(图1a)。研究进一步对Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶进行了表征，横截面形态显示Fe₂O₃纳米颗粒嵌入在水凝胶的内部区域(图1c)，此外通过元素分析证明了Fe₂O₃纳米颗粒的存在，发现铁元素均匀参杂再杂化水凝胶中(图1e)，并且通过红外光谱分析证实了磁性纳米颗粒与GelMA交联(图1f)。随着Fe₂O₃纳米颗粒浓度的增加，Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶的颜色逐渐加深(图1g)。Fe2O3/GelMA水凝胶的溶胀率随着Fe₂O₃纳米颗粒的加入而降低，这可能是杂化水凝胶交联增加的原因(图1i)。除了这些特性，有趣的是，研究发现可以通过控制Fe₂O₃纳米颗粒的浓度来调节Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶的机械强度。可调刚度水凝胶平台与软骨细胞之间的相互作用尚是怎样的呢？为了揭示这个问题作者进行了后续研究。

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图1. Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶的合成及其在软骨修复中的潜在应用。a.Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶的形成示意图；b. Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶的概况；c.显示乙烯基包裹的Fe₂O₃纳米颗粒(MPS- Fe₂O₃)和Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶的放大横截面形态；d.Fe₂O₃纳米颗粒的粒径；e. Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶的元素映射分析，显示出氧、氮和铁的存在；f.MPS-Fe₂O₃、GelMA及Fe₂O₃/ GelMA杂化水凝胶的FT-IR分析; g.体视显微镜下不同Fe₂O₃浓度的Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶的形态；h.研究了培养皿、纯GelMA水凝胶(凝胶对照)和Fe₂O₃/GelMA混合水凝胶的表面粗糙度结果; i.Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶的溶胀率。j.不同Fe₂O₃纳米颗粒浓度下GelMA水凝胶和Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶的杨氏模量。

为了探索软骨细胞与Fe₂O₃/GelMA混合水凝胶之间的相互作用，首先将软骨细胞植入Fe₂O₃/GelMA混合水凝胶中，检测基底细胞的变化(图2a)。二者经过较长时间（9天）相互作用，细胞活力无明显变化(图2b)。接着利用扫描电镜(SEM)深入研究软骨细胞的细胞形态变化(图2c)，根据细胞接种后8、24和72 h的形态学图像发现Fe₂O₃纳米颗粒浓度越高(机械强度越高)的水凝胶上细胞扩散面积越大。细胞扩散面积的定量结果同样也证实这一结论(图2d)。接下来，表征了f-肌动蛋白的微丝组织。f-肌动蛋白在硬度更高的水凝胶上更有序(图2e)。且微丝组织形态从碎片状(水凝胶控制或低Fe₂O₃组的较软底物)到束状(高Fe₂O₃组的较硬底物)（图2e)，f-肌动蛋白成束长度也发生了变化(图2f)。最重要的是，使用带有改进压痕探针的AFM研究发现细胞杨氏模量随水凝胶刚度的变化而变化(图2g)。综上所述，这些结果表明Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶作用后软骨细胞的物理性质发生了变化。

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图2.Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶对软骨细胞物理性质的影响。a.用Fe₂O₃/ GelMA混合水凝胶浇灌软骨细胞后，细胞物理性质的变化示意图；b.CCK-8试剂盒检测软骨细胞Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶相互作用的总活性；c.扫描电镜观察Fe₂O₃/ GelMA凝胶在细胞接种72h内软骨细胞的形态变化；d.Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶的软骨细胞扩散区域分析；e.细胞骨架变化; f.在Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶上接种的软骨细胞中f -肌动蛋白束的长度; g. Fe₂O₃/GelMA混合水凝胶对软骨细胞杨氏模量的影响。

由于Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶改变细胞生物学特性，随即研究了互作过程中模型的能量代谢变化。通过检测结果软骨细胞的耗氧率(OCR)、直接反映糖酵解的细胞外酸化率(ECAR)和软骨细胞总ATP（图3a.b.c）,发现有氧呼吸在软骨细胞的生理活动中起着重要作用。进而将软骨细胞放在Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶上3天后检测其线粒体数量的变化(图3e.f.g)，发现随着Fe₂O₃浓度的增加，线粒体在水凝胶上的生长数量增加。由于线粒体的融合/裂变动力学是由AMPK信号直接介导的，特别是裂变或生物发生,因此进一步检测了总AMPK和磷酸化AMPK信号，结果显示在水凝胶作用下，总AMPK和磷酸化AMPK在软骨细胞中的表达均随Fe₂O₃浓度的增加而增加（图3h.i)。并且基于硫铁蛋白(铁(Fe)/硫(S))是线粒体呼吸链前三步的先决条件(NADH脱氢，琥珀酸氢化和细胞色素还原过程，如图4a中紫色所列)，进一步检测参与有氧呼吸链和线粒体生物合成的所有18个已知的Fe/S簇装配蛋白。

RNA测序结果显示，其中7个基因的mRNA转录量增加(图4b)。重要的是，检测到负责铁的摄取和隔离、转铁蛋白受体的表达和铁蛋白水平的铁调节蛋白1 (IRP1)和2 (IRP2)，在Fe₂O₃/GelMA混合水凝胶的反应中的软骨细胞上高度表达。此外我们还检测到线粒体电子传递链中驱动氧化磷酸化的最后一种酶环氧化酶-2 (COX2)和移动电子载体的细胞色素c (Cyt c)增加，呼吸链的增强导致更多的ATP生成，以满足软骨细胞的生理需求(图S6A)。有利于软骨损伤的修复。从RNA测序数据中，我们发现了与线粒体相关的其他表达改变的基因(图5a),其中大多数有利于线粒体ATP的产生,过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路是主要的改变途径(5b).软骨细胞和Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶之间的细胞-基质相互作用增强了线粒体的呼吸链。接下来，我们通过代谢组学的方法通过线粒体有氧呼吸的扰动检查了代谢物的所有副产物(图6)。

与GelMA对照相比，筛选了与Fe₂O₃/ GelMA杂交水凝胶相互作用的软骨细胞中的4019种代谢物。通过fold change≥2且p值< 0.05的阈值进行筛选，发现低、中、高Fe₂O₃浓度的水凝胶代谢产物分别发生了23、51和125个变化。在这些变化的代谢物中，我们分析了脂质代谢物，并显示了它们在总变化代谢物中的比例(图6b)。在低、中、高Fe₂O₃浓度的水凝胶中，分别有6、9、21个脂质代谢物发生了变化(图6c)。聚焦于四个共同增加的脂质代谢物饱和脂肪酸代谢物壬酸、磷脂酰胆碱(PC)代谢物戊内酯D、 脂肪醛代谢物2-棕榈酰丙三醇和肉豆蔻醛，这四种代谢物表明了Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶对软骨细胞脂质分解代谢的影响。

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图3. 与Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶相互作用的软骨细胞线粒体活化。a.显示与Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶相互作用的软骨细胞线粒体呼吸能力的直方图；b.直方图显示糖酵解软骨细胞与Fe₂O₃/GelMA混合水凝胶相互作用；c. ATP发光计进一步证实了与Fe₂O₃/GelMA混合水凝胶相互作用的软骨细胞中总ATP的生成。；d.一个示意图显示了正常软骨细胞代谢类型的比例(上)和代谢类型与Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶相互作用的变化出现在线粒体介导的有氧磷酸化中(下)；e.代表性线粒体染色显示了Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶接种72小时后活软骨细胞中线粒体数量的变化；f.代表性透射电镜显示了Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶接种72小时后软骨细胞中线粒体数量的详细变化，紫色箭头表示线粒体；g. f中线粒体数量的定量；h. Western blotting显示了总蛋白和磷酸化AMPKα1的变化，这是Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶中软骨细胞线粒体数量变化的原因；i.用western blotting对总AMPKα1和磷酸化的AMPKα1进行定量。

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图4.增强软骨细胞线粒体呼吸链与Fe₂O₃/ GelMA杂交水凝胶相互作用。a.软骨细胞与Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶之间的相互作用促进软骨细胞线粒体呼吸链的前三个阶段。蓝色的I, II和III表示线粒体呼吸链在能量产生中的三个阶段; b. 线粒体呼吸链18个基因表达Heatmap图，有8个基因表达增强，尤其是IRP1和IRP2；c. Western blotting显示在Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶上接种的软骨细胞中IRP1和IRP2蛋白的变化；d. Western blotting显示Fe₂O₃/ GelMA杂交水凝胶上的软骨细胞中COX2和细胞色素c(Cyt c)的蛋白质变化；f.光学密度计显示了Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶上的软骨细胞释放的活性氧的变化。

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图5.软骨细胞与Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶相互作用的关键信号激活。a.线粒体中的总基因Heatmap图；b.软骨细胞细胞质中的前十个候选基因Heatmap图，通过增强线粒体有氧磷酸化，脂质分解代谢增强；c. Western blotting显示Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶接种软骨细胞后，PPARα Angptl4、Cyto P450 2E1和Apoe蛋白的变化；d.磷酸化PPARα信号的核积累CLSM图像；e. PPARα信号核积累荧光OD定量；f. Cyto P450 2E1在Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶上的软骨细胞中的分布变化的CLSM图像。

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图6.与Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶相互作用的软骨细胞代谢组学表明脂质分解代谢的产物。a.与GelMA对照组相比，低(左)、中(右)和高(右)浓度的GelMA凝胶中与Fe₂O₃杂交的所有代谢物的变化火山图(p < 0.05和FC≥2); b.脂质代谢物占总代谢物的比例的饼状图；Gel-Fe-low、Gel-Fe-medium和Gel-Fe-high三组均与GelMA对照组进行比较；c.与GelMA对照组相比，GelMA凝胶与Fe₂O₃在低(左)、中(右)和高(右)浓度下杂交的四种常见的脂质代谢物的变化火山图(p < 0.05和FC≥2); d.在Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶上生长的软骨细胞中，四种常见的脂质代谢物变化的热图；e.在Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶中生长的软骨细胞中四种脂质代谢物与GelMA对照组相比的特定折叠变化的直方图；f.2-palmitoyl- rac-glycerol-M在不同组中的分布。

为了检验Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶是否能促进软骨缺损的修复。作者建立了大鼠软骨缺损模型，将混合水凝胶植入到缺陷中(使用高Fe₂O₃浓度的水凝胶)，并在植入手术后1、3和6周收集膝关节样本(图7a)。通过观察缺陷愈合的形态表征Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶的缺陷修复能力(图7b)，结果表明，Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶对大鼠软骨缺损具有较好的修复能力。

为了进一步分析修复软骨缺损部位的组织学变化，我们进行了番红花素O染色(图7c)。结果表明，在早期(术后1周)，植入Fe₂O₃/GelMA混合水凝胶后的软骨缺损可以招募更多的细胞，包括外周软骨细胞。术后6周，在缺损部位新形成的组织中大量蛋白多糖基质积累。通过μ-CT，还发现术后6周新形成的组织含有类骨成分(图7d)。此外，我们使用ALP和阿利新蓝联合染色来表征缺陷部位新形成的组织，发现成骨细胞(ALP，红色)和软骨细胞(阿利新蓝，蓝色)在新形成的组织中共存(图7e)。

最后对Fe₂O₃/GelMA水凝胶植入软骨缺损区的组织进行了为期6周的深入生化分析。首先对冷冻切片通过H&E染色表征缺损区域的重塑形态(图8a)，结果发现对于缺陷组和GelMA组，Fe₂O₃/GelMA水凝胶组在缺损区域聚集了新的组织填充物。进一步通过von Kossa染色进行矿化分析，Fe₂O₃/GelMA水凝胶植入的缺陷区域存在弱矿化形成(图8b)，结合骨样成分分析(图7e中的ALP染色)，表明这些新形成的组织含有主要来源于软骨下骨的成骨成分。进一步，通过免疫荧光染色检测到新形成的组织中高度表达的阳性II型胶原蛋白(Col2)和高表达的Sox9蛋白(图8c)。最后通过检测缺陷区域/周围的CD3、F4/80和CD11c的表达表征缺损区域周围炎症的发生情况(图8d)。结果显示缺陷组中的炎性介质的表达高于Fe₂O₃/GelMA水凝胶组，表现出高炎症(图8d中的紫色箭头)，而Fe₂O₃/GelMA水凝胶组的低炎症反应有利于新组织的形成。

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图7. Fe₂O₃/GelMA水凝胶在大鼠软骨缺损模型中的应用。a. Fe₂O₃/GelMA水凝胶植入大鼠软骨缺损示意图; b. Fe₂O₃/GelMA水凝胶植入大鼠软骨缺损的形态学研究; c.软骨缺损区域软骨蛋白聚糖聚集Safranin O染色图；d.软骨缺损区类骨成分的生成μ-CT图；e. Fe₂O₃/GelMA水凝胶的植入促进软骨缺损的重塑，圆圈内的组织染色显示成骨细胞(ALP染色，红色)和软骨细胞(阿利新蓝染色，蓝色)在重塑区共存(快绿反染显示背景，绿色)。

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图8. Fe2O3/GelMA水凝胶植入手术6周后软骨缺损区的评价。a. Fe2O3/GelMA水凝胶的软骨缺损区H&E染色图；b.软骨缺损区矿化结果图；c.胶原II (Col2)、Sox9和胶原X (ColX)免疫荧光染色结果；d. CD3、F4/80和CD11c免疫荧光染色结果。

研究结论

该研究设计了一种基于磁性纳米颗粒交联GelMA且刚度可调的水凝胶平台，当软骨细胞与Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶相互作用时，软骨细胞的细胞物理性质和代谢状况都发生显著变化，其中软骨细胞线粒体氧化磷酸化增加，细胞脂质分解和响应PPARα信号激活的细胞脂质代谢物发生变化。以上的这些细胞行为变化都可归因于水凝胶刚度（生物物理）和痕量铁离子释放（生化）的综合效应。进一步将Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶在体内进行应用，在大鼠软骨缺陷模型中发现Fe₂O₃/GelMA杂交水凝胶具有促进缺陷修复的巨大潜力。综上所述，本研究对软骨细胞与杂化水凝胶之间的相互作用提供了深刻的见解，并指出了Fe₂O₃/GelMA杂化水凝胶在组织工程中进一步应用的巨大潜力。

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图9.基于Fe2O3/GelMA混合水凝胶的可调刚度共培养软骨细胞的细胞物理生物学特性变化及其在大鼠软骨缺损模型重构中的进一步应用示意图

科研延伸

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