ABI小贴士 | 实时荧光定量PCR不完全使用指南

可能是由于在PCR循环步骤没有设置采集荧光的步骤，而熔解曲线默认采集荧光，所以只有熔解曲线，没有扩增曲线。

（在set up的run methods里如果把40个扩增时60度1分钟下面的小方框单击可以去掉，这个时候就不会采集荧光信号了，且按理说后面的溶解曲线也是没有的，只能在multiple component那里看到图）

可以这样设置，但实验结果可能会有偏差。

如果熔解曲线出现双峰，证明扩增产物中有两种产物，或者为引物二聚体。或者为非特异性产物。可以重新设计引物，或者优化PCR反应条件。

重复性不好的原因很多，大部分是因为加样不准确造成的。

可能原因为基线终止循环设置不正确，可以手动设置基线，重新分析即可。

(在analysis选项里，可以将基线的auto设置前的勾去掉，则可以对基线进行手动设置，拉动x轴下方的小三角形，往ct值大的方向拉动，重新analysis，然后选择线性图，可以看到扩增曲线会变形。或者可以在analysis settings中手动修改基线的起始和终止循环)

1、 标准品浓度太低，即使是最高浓度标准品Ct值也大于25接近30，低浓度的DNA样品保存时间较长会有降解现象出现。因此建议将标准品浓缩。

2、 标准品倍比稀释2倍稀释造成稀释不好，建议10倍倍比稀释，且采用逐步倍比稀释的办法，比如将10v的高浓度标准品a加入90v的水中得到10倍稀释后的标准品b，彻底混匀之后再吸取10v的b加入90v的水中......

探针质量不好比如部分降解会干扰基线且使得PCR效率不高，试剂质量不好也会出现PCR效率不高等问题，这些问题都会使得扩增曲线异常，而不是标准的s形

需要通过添加customer dye，对HEX进行校正。（HEX不是ABI进行过校准的荧光，所以客户使用这类荧光标记探针时，必须使用纯的荧光（即customer dye）运行一次进行校正）

做一次清洗之后做背景校正，然后再用标准品做一次试验，如有上述现象，工程师要测量仪器的孔间温度

先开电脑，之后开主机，再开软件

建议选择FAM、VIC、NED标记。

今天是世界卫生组织确定的第五个“世界肝炎日”，宣传主题是：战胜肝炎，从我做起。我国国家卫生计生委将“世界肝炎日”主题确定为“抗击肝炎，预防先行”，副标题为“疫苗接种好，铸就健康路”。赛默飞呼吁大家做好疫苗接种，防止从我做起。