导读：使用脂质纳米颗粒（LNP）递送mRNA是一项变革性技术，使全球数十亿剂COVID-19疫苗的快速开发和管理成为可能。然而，mRNA-LNP潜在的毒性风险包括IVT RNA的免疫原性、LNP脂质成分、工艺相关杂质等。如何避免mRNA药物和疫苗潜在的毒性仍是一种挑战。

2024年1月，美国东北大学与mRNA领军企业Moderna、Intellia联合在Nature Reviews Drug Discovery（一区，影响因子120）发表重磅综述文章：《Strategies to reduce the risks of mRNA drug and vaccine toxicity》。该综述结合实际案例，探讨了mRNA-LNP的风险来源和降低毒性风险的有效策略，且覆盖了mRNA疫苗、mRNA蛋白替代疗法和基因编辑疗法等多领域。

认知mRNA-LNP制剂的毒性风险是控制其风险的必需条件。本系列文章，菌菌将分期解析mRNA-LNP制剂的毒性风险来源和控制策略，包括IVT RNA免疫原性、LNP脂质毒性、以及如何借助下一代非临床模型研究mRNA毒理学。本篇我们将分享降低IVT RNA免疫原性的策略。

与传统疫苗、药物开发相比，mRNA技术具有制备时间短，经简单序列变化实现应用多样性等优势。短期内针对新冠病毒原始毒株，以及联合变异株omicron B.1.1.529的二价疫苗的开发表明，mRNA技术在临床中的快速改进，且二价疫苗相较于原始菌株疫苗对omicron的中和抗体反应更强。

几十款基于mRNA技术的预防性疫苗、治疗性疫苗、治疗性药物（蛋白替代疗法）和基因编辑疗法正在开展临床试验，用于呼吸道和潜伏病毒、癌症、自身免疫性疾病、基因缺陷等罕见病等。

这里写个题外话，作者单位之二的Moderna和Intellia是mRNA行业的领军型企业，因此这篇文章的实用性很强。其中Moderna是mRNA疫苗的龙头企业，新冠疫苗mRNA-1273的快速获批使其名声大震，Moderna在研的mRNA管线还包括mRNA流感疫苗、mRNA呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗、mRNA巨细胞病毒（CMV）疫苗、mRNA肿瘤治疗性疫苗和罕见病蛋白替代疗法等。而Intellia专注于以mRNA为基础的CRISPR体内基因编辑技术，通过LNP将Cas9 mRNA和向导RNA（gRNA）递送至体内，发挥靶基因编辑效应。Intellia的代表性管线包括NTLA-2001、NTLA-2002等，其中NTLA-2001特异性敲除人转甲状腺素蛋白（TTR）基因，目前处于后期临床阶段。

确定蛋白质靶标后，其mRNA序列通过体外转录（IVT）合成：线性质粒DNA与核糖核苷酸通过噬菌体RNA聚合酶结合合成RNA，但未经修饰的IVT mRNA存在异常免疫原性和低效的细胞内递送。

2.1 IVT mRNA免疫原性来源

未修饰的IVT mRNA可能含有双链区域（如发夹结构），该区域可结合并调节TLR3的表达，激活NF-κB，增加树突状细胞（DCs）内TNFmRNA水平和IL-8分泌（HEK293细胞）。IVT mRNA激活DCs中的干扰素调节因子1（IRF1），并增加IL-1受体相关激酶M（IRAK-M或IRAK3）的mRNA水平。未修饰的IVT mRNA也可触发TLR7或TLR8并产生促炎细胞因子。从未修饰IVT mRNA的无启动子末端转录产生互补的反义RNA；产生的dsRNA刺激MDA5（胞质PRR），上调IFNβ。

图1 对未修饰的IVT mRNA的先天免疫应答

2.2 消除IVT mRNA的免疫原性

降低IVT RNA的异常免疫原性对于其临床转化是必需的，目前的策略如下：

（1）核苷甲基化和假尿苷掺入：可抑制IVT ssRNA的先天免疫识别，如ssRNA含假尿苷、N6-甲基腺苷、5-甲基胞苷或2-硫代尿苷时，DCs的TNF或IL-12分泌减少。

（2）dsRNA去除：有报道显示，改造筛选的T7 RNA聚合酶突变体可减少IVT mRNA中的dsRNA，抑制体外免疫刺激。通过层析纯化去除IVT mRNA中的dsRNA，可抑制其免疫原性，提高安全性和蛋白翻译效率。耀海生物自主开发了mRNA层析纯化工艺，能够有效去除dsRNA至0.06%以下(ELISA方法)。详情可咨询菌菌：13380332910（微信同号）

（3）其他修饰：在模板编码3′poly（A）的尾部添加120-150个腺嘌呤，促进翻译的启动并增强mRNA稳定性；与假尿苷相比，N¹-甲基假尿苷（1mψ）增强转染效率并降低免疫原性，且经纤维素纯化后的dsRNA残留水平与RP-HPLC相当。

（4）环状mRNA可延长细胞内半衰期。与线性mRNA相比，circRNA具有更好的稳定性和更低的免疫原性，并且可能改善药代动力学。目前circRNA面临解决的问题是环化率的提升与nicked RNA的去除。

文章汇总了mRNA毒性风险的来源和消除措施。简而言之，mRNA的免疫原性来源主要为mRNA自身的免疫原性、以及IVT RNA合成过程中产生的副产物dsRNA。其改善策略包括：核苷酸修饰、筛选T7 RNA聚合酶或优化IVT体系降低dsRNA的生成、利用层析等方法有效去除dsRNA等。

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