基于脂质纳米颗粒的递送系统——mRNA疫苗的竞争领域

mRNA作为近十年来生物医学研究的重点之一，因其高效、安全、有效等特点，已成为各种传染病和肿瘤以及再生医学和免疫治疗的候选疫苗解决方案。但是需要一个稳定有效的递送系统来保护mRNA免受核酸酶降解，同时增强免疫原性。这篇文章探讨了mRNA疫苗递送系统，特别是脂质纳米颗粒（LNPs），同时考虑了脂质纳米颗粒的研究现状、前景和挑战，并探索了其他mRNA递送系统。

在 1960 年代，出现了第一代 LNP，称为脂质体。它们在水中产生，并具有封闭的磷脂双层。脂质能增强药物的水溶性；因此，它们被认为具有作为药物输送系统的潜力。近年来，纳米技术得到了发展，纳米脂质体的功能进一步发展，实现了简单的靶向或其他简单的功能。近年来开发用于 mRNA 递送的 LNP 由可电离阳离子脂质、磷脂、胆固醇、聚乙二醇 （PEG） 脂质和 mRNA 组成。

图1.mRNA-LNP的组成。

mRNA：核心活性成分；可电离阳离子脂质：静电吸附核酸和包封核酸；磷脂：加速细胞中LNP的结构转化；胆固醇：LNP的稳定结构，使LNP可以通过低密度脂蛋白（LDL）进入细胞；PEG：提高LNP稳定性，延长体内循环时间，并在一定程度上降低肝脏富集。

可电离阳离子脂类

离子化阳离子脂质对pH值敏感，它们的头基团可以转移电荷，从低pH下的正电荷状态转变为生理pH下的中性状态。这允许mRNA - LNP复合物的形成，LNP以pH依赖的方式为mRNA提供了一个安全稳定的环境。可电离的阳离子脂质可以在血液中保持中性，因此LNPs释放的mRNA的pH值可以调节以降低毒性。此外，在内体的低ph环境中，可电离的阳离子脂质可以获得正电荷，这使得内体包膜不稳定，使纳米颗粒从内体中逃逸。

聚乙二醇

脂质纳米颗粒的另一个关键成分是聚乙二醇，它对它们的性质有重要影响。在LNP结构中最常用的PEG是PEG2000 (PEG, MW = 2000)， Oberli等人的研究表明，PEG2000有助于形成更小的LNP颗粒尺寸和更强的T细胞反应。Rondine等人研究了PEG-肽复合物的构效关系对Kupffer细胞摄取的影响，发现PEG的分子量越小，在肽结构固定的情况下，纳米颗粒的肝逃逸效应越明显。PEG可提高mRNA LNPs逃避巨噬细胞调节和吞噬的能力。当使用PEG2000时，对PEG密度和链长的调节使其能够通过空间位点屏障干扰调节剂分子(如C3b和iC3b)与巨噬细胞上表达的相应受体的结合，增强PEG链的移动性，柔软性和拉伸性质。LNPs表面的PEG可以稳定LNPs的空间结构，防止LNPs与某些蛋白质的非特异性结合。由于其亲水性，PEG链的加入导致LNPs的排除体积很大，这减少了LNPs与邻近LNPs或血液成分的相互作用。PEG构象的灵活性，具有很大的自由度，使得PEG电晕的热力学互穿对其他物质不利。因此，PEG的加入可以显著延长LNPs的体内循环时间。LNPs中PEG含量通常与血液循环时间呈正相关。

其他脂质

除了可电离的阳离子脂质外，胆固醇、磷脂和聚乙二醇都是LNPs的组成部分。胆固醇是LNPs稳定性的关键。其在细胞转染实验中的作用已得到证实。当转变温度较低时，LNPs中的胆固醇含量必然增加，从而导致LNPs从片层相转变为六方相。这些过程是LNPs释放mRNA并与内体膜相互作用所必需的。磷脂在LNPs中的作用是稳定结构，这与磷脂双分子层的形成和破坏促进核内体逃逸有关。此外，一些磷脂表现出多态性，这可以导致内膜从层状变为六边形。此外，带负电的磷酸基团可能参与阳离子中和，也有助于相变和体内逸出。

LNP 已被研究为封装小分子、核酸、小干扰 RNA （siRNA） 和 mRNA 的药物递送系统。可电离阳离子脂质含有可电离胺基团、自组装疏水尾部和连接器。进入体内后，其在酸性环境中被电离，有助于形成六方相，促进mRNA在体内降解中逸出并释放到细胞质中。PEG脂质的选择取决于PEG的摩尔质量和长度，这会影响整体结果，包括靶向递送和细胞摄取效率。辅助脂质和胆固醇也有助于LNP的形成，从而有助于LNP的流动性（或刚性）。

尽管获得美国食品和药物管理局 （FDA） 的批准和紧急使用授权 （EUA），但 LNP 仍然存在许多无法绕过的问题。LNP需要克服通过肝脏系统的困难，必须首先从Kupffer细胞（驻留在肝脏中的巨噬细胞）中分离纳米颗粒。肝脏中的 Kupffer 细胞可以吸收不同大小的 LNP。此外，LNP还与肝正弦内皮细胞（LSEC）相互作用，以阻止LNP通过肝脏系统。

图2.mRNA-LNPs在通过肝道时被带有LSEC的Kupffer细胞吸收，导致不必要的肝脏富集。

这些药物中共有30-90%集中在肝脏中，这导致非肝脏靶向给药期间药物脱靶，从而影响治疗效果。此外，即使是FDA批准销售的LNP，也只有1-4%的核酸有机会从内体中逃逸并到达细胞质，这是LNP进入细胞后发挥作用的主要屏障。

当mRNA的体内传递首次被研究时，病毒作为天然的核酸传递系统首先引起了研究者的注意。然而，大多数病毒仍然是危险的，因为它们的自整合DNA和致病性。降低风险的病毒载体仍然不能完全解决这些缺点，而且很难生产。非病毒载体本身带负电荷，与带负电荷的mRNA相互作用，结合mRNA并通过内吞作用进入细胞。这种方法规避了病毒载体的缺点，但导致转染效率降低。在20世纪90年代，研究人员尝试使用阳离子脂质体和鱼精子蛋白等作为输送系统，随后又进一步尝试使用可生物降解的、可电离的聚合物。然而，这些材料结构复杂、毒性大、转染效率低，使其无法进入临床。LNPs具有良好的生物相容性和较高的转染效率，并且毒性大大降低，在一定程度上解决了这些问题。因此，LNPs已成为最广泛使用的mRNA传递系统，并且比其他传递系统具有优势。

当引入 mRNA 疫苗的概念时，研究人员首先尝试使用体外转录 （IVT） mRNA 作为保护性疫苗。然而，在大多数情况下，裸 IVT mRNA 不足以驱动完全的保护性免疫，尽管mRNA与鱼精蛋白的络合有效地增强了核酸的免疫刺激潜力，但它仍然与降低其可翻译性的风险有关，从而降低了疫苗的预防作用。mRNA 疫苗的另一个挑战是无法在树突状细胞 （DC） 中发挥正确的功能，这可能需要特殊手段来引导 DC 激活。此外，mRNA的体内稳定性差，对核酸酶降解的敏感性，以及它们的高分子量（MW）和高负电荷，阻止它们通过被动扩散进入细胞，也是需要解决的问题。LNP是递送mRNA疫苗的常用非病毒载体，在保护mRNA免受核酸酶降解和促进抗原呈递细胞（APC）摄取以及携带其自身的佐剂作用以增强mRNA编码的内源性蛋白质的免疫原性方面显示出巨大的潜力。

mRNA 疫苗依靠 LNP 与细胞膜的相互作用，将编码抗原的 mRNA 分子递送至接种的单个细胞的细胞质，其中 mRNA 可以翻译成内源性免疫原性蛋白以引发免疫反应。当病原体入侵时，宿主可以依靠其免疫记忆快速反应以清除抗原。mRNA-LNP通过内吞作用进入细胞，它们可以形成进入细胞质的内体。内体内部的酸性环境导致可电离阳离子脂质（LNP 的成分之一）的头基质子化并携带正电荷，从而吸引并结合内体组中磷脂的阴离子头基。结合后，阳离子脂质和磷脂的疏水尾部膨胀，内体膜被破坏，从而使细胞质mRNA翻译。体液免疫的mRNA激活与大多数常规疫苗相似，尽管目前尚不完全了解CD8 + T细胞的确切激活过程，但内源性抗原被认为是有效的条件，抗原肽需要通过主要的组织相容性复合物I类（MHC I）分子途径呈递给CD8 + T细胞，mRNA疫苗可以很好地做到这一点，同时发挥体液和细胞免疫。

图3.mRNA-LNPs被摄取的过程和诱导适应性免疫的机制。（A） mRNA-LNPs通过胞质溶胶进入细胞质，释放mRNA，并被翻译成作为免疫原的蛋白质。

（B）内源蛋白被蛋白酶体降解为肽，并由MHC I呈递给CD8+ T细胞进行活化，而在膜上表达或分泌的蛋白也可以被抗原特异性B细胞识别为B细胞活化的信号。

（C） 从 mRNA 翻译的蛋白质也可以激活 CD4+ T 细胞。

mRNA疫苗已成为传统疫苗的有前途的替代平台。它们易于生产、成本低、安全且高效，使其成为预防和治疗传染病的理想候选者。辉瑞/Biontech 和 Moderna 是两种 COVID-19 mRNA 疫苗（BNT162b2 和 mRNA-1273），已获批准并显示 94.1% 和 95% 功效。mRNA在抗击COVID-19方面的成功给了人们信心。mRNA-LNP也应用于寨卡病毒和流感病毒(H7N9和H10N8)。小鼠和非人灵长类动物在接种两剂或更多单剂疫苗后，对寨卡病毒产生高中和抗体滴度(1/100,000)；在小鼠和雪貂中，单剂量疫苗可产生针对H7N9和H10N8的HA抑制和强效中和抗体，这些抗体已在针对多种病毒(包括埃博拉病毒、HIV-1和尼帕病毒)的临床前研究中进行了研究。这些研究表明，疫苗能够诱导高糖蛋白特异性中和抗体滴度以及抗体依赖性细胞毒性，从而保护动物免受致命病毒的攻击。以巨细胞病毒(CMV)、vzv、RSV和狂犬病毒的糖蛋白为免疫原时，mRNA-LNPs也表现出较强的免疫强度。

链分子起作用。基于mRNA的癌症疫苗编码免疫反应过程的关键成分，如肿瘤特异性抗原(TSA)、肿瘤相关抗原(TAA)和免疫调节因子，促进免疫激活以实现抗肿瘤功能。注射后，mRNA癌症疫苗被传递到APC的细胞质中，随后被翻译成新抗原蛋白并刺激TLR7和TLR8。随后，成熟的APC被转运到淋巴结，在那里它们产生显著的体液和细胞免疫。与传统疫苗相比，mRNA疫苗可诱导更有效的I型干扰素应答，并有效触发人CD8+ T细胞应答，在肿瘤根除中发挥关键作用。在之前的一项研究中，Oberli等人设计并优化了LNP文库，用于递送编码模型抗原卵清蛋白(OVA)的mRNA疫苗。该疫苗成功诱导了强效CD8+ T细胞活化和免疫应答。成功诱导CD8+ T细胞活化，延长B16F10黑色素瘤患者的总生存期。B16F10黑色素瘤模型的总生存期延长。在另一项研究中，Bevers等人通过调整mRNA- LNP配方中四种组分的物质浓度来优化mRNA- lnp配方，以优化编码HPV16.58的mRNA- LNP疫苗的递送。优化后的mRNA- lnp疫苗诱导了强烈的CD8+ t细胞应答，并增强了mRNA进入细胞的摄取。这些结果证明了将mRNA-LNPs用作癌症疫苗的可行性。

Malone等报道阳离子脂质DOTMA可作为mRNA转染试剂将mRNA转运到细胞内。然而，它在体内具有促炎和促凋亡的毒性，因此在循环过程中被迅速去除。因此，由于可电离脂质可以促进mRNA逃逸到核内体并在生理pH下被中和，它们可以更稳定，更安全，更适合mRNA疫苗递送系统。Ampatro的DlinMC3-DMA是全球首个获FDA批准的siRNA药物中LNP配方的主要成分。

图4.Dlin-MC3-DMA (A)、SM102 (B)和ALC-0315 (C)的分子式。

然而，DlinMC3-DMA中亚油酸的烷基尾不易降解，当该化合物的用量过高时可能导致毒性。辉瑞/Biontech和Moderna两种新型COVID-19 mRNA疫苗(BNT162b2和mRNA-1273)最近获得FDA批准，Moderna产生的脂质被称为SM-102(也称为脂质H；图4 b)。其尾部分支较多，可以增加药效，且该尾部引入的酯键提高了其体内生物降解性和安全性。几乎与此同时，Biontech将化学结构与SM-102相似的ALC-0315(图4C)作为其COVID-19 mRNA疫苗LNP配方中的可电离脂质。两种mRNA疫苗的保护作用都在90%以上。对接种这两种mRNA疫苗的人群的监测显示出良好的保护效果，尽管对突变的保护可能相对较差。Moderna制备的LNPs的摩尔比为SM-102: PEG:胆固醇:磷脂(DSPC) = 50:1.5: 38.5: 10。辉瑞/Biontech开发的LNP配方的摩尔比为ALC-0315: PEG:胆固醇:磷脂(DSPC) = 46.3: 1.6: 42.7: 9.4.95，两种配方的LNPs粒径约为80 ~ 100 nm，含有约100个mRNA分子。除了上述三种获批的LNP外，还有相当数量的基于LNP的产品正在临床试验中。

LNP的靶向

当LNPs被静脉注射(IV)或肌肉注射(IM)时，大部分LNPs在肝脏积累，这与mRNA疫苗实现功能的初衷相矛盾。研究人员正试图修饰LNPs以改变器官靶向。LNPs的电荷、组成和大小会影响它们的递送、吸收和器官分布。最近的研究表明，改变LNPs的表观酸解离常数(pKa)可以使LNPs靶向肝外组织(如脾或肺)。肝脏富集LNPs的pKa一般在6 ~ 7之间；当pKa在2 ~ 6之间时，LNPs表现出良好的脾富集能力脾脏靶向。上述现象可能是由于不同可电离阳离子脂质的不同头基团决定pKa，决定LNPs的表面电荷差异，影响其与不同类型血清蛋白相互作用的能力，最终导致其在体内的分布不同。LNPs的表面负电荷与其在脾脏中的摄取有关。Cheng等人最近发现，第五种成分的存在，称为“选择性器官靶向(SORT)”，可以改变LNPs在体内的器官靶向作用研究表明，SORT脂质可以影响LNPs的表观pKa值以及LNPs与血清蛋白的相互作用。改变SORT脂质的数量和类型可以使LNPs具有不同的靶向选择性，但是LNPs靶向细胞的能力与第五组分的结构无关。目前，LNP-SORT平台已经建立。Okuda等报道颗粒大小也是影响LNPs靶向偏好的因素之一。他们发现，在mRNA缓冲液中添加盐可以将颗粒大小增加到约200 nm，从而使颗粒更多地进入小鼠脾脏淋巴细胞和DC，而不会改变LNP的组成或有效激活免疫细胞。

给药方式

除了修饰LNP本身外，局部给药，如通过淋巴结肌内注射，也可以增加LNP的靶向潜力，从而阻止它们在全身给药后到达特定器官，并有助于LNP的选择性递送。在临床前或临床试验中，LNPs主要通过皮内、皮下或肌肉注射给药，使其靶向附近的引流淋巴结，向T细胞呈递抗原，使抗原暴露于B细胞，激活免疫反应。目前市场上的两种COVID-19 mRNA疫苗均通过肌肉注射给药。对于肿瘤疫苗，除以上三种途径外，结肠给药、鼻滴注给药或瘤内给药也可提高LNPs的靶向性和疗效。

内体逃逸

LNPs进入靶细胞后，其mRNA必须从胞内膜逃逸到细胞质中，并被翻译成靶蛋白发挥功能。然而，大多数mRNA由核内体转运到溶酶体降解，只有一小部分可以逃逸到细胞质中。这种情况是50多年来递送的主要障碍，也是LNPs应用中需要解决的另一个主要问题。