Cell | 双向奔赴！细胞间通过代谢物交换让彼此一起延寿！

为了研究时序性寿命（CLS，是一个基本的衰老模型，监测细胞在静止期（有丝分裂后的细胞）的存活情况）实验中的代谢，使用常用的酵母菌株BY4741，细胞在基础培养基（缺乏氨基酸补充）中分批培养，先后经历指数期、早期静止期和静止期。通过靶向代谢组学技术检测细胞内的氨基酸和核苷酸以及糖酵解和三羧酸（TCA）循环的中间产物，结果显示，与从发酵到氧化代谢的转变一致，糖酵解代谢物的总体浓度减少，而TCA衍生的代谢物的浓度增加。此外，在早期静止期和静止期，当生长停止时，核苷酸的浓度减少。虽然整体氨基酸的中位数浓度在静止期增加，但浓度范围明显扩大。例如，异亮氨酸（I）、甘氨酸（G）和亮氨酸（L）从指数期到静止期增加，但天冬氨酸（D）、丙氨酸（A）和谷氨酸（E）减少。

由于氨基酸被酵母细胞输出到周围环境中，随后检测细胞外氨基酸浓度。结果显示，尽管在缺乏氨基酸补充剂的基础培养基中接种了细胞，但到指数期，酵母细胞已经外排出了氨基酸，达到了明显的细胞外浓度；在早期静止期或静止期，19种氨基酸中有14种涨幅>10%。与指数期相比，只有丙氨酸（A）、天门冬氨酸（D）、苯丙氨酸（F）和缬氨酸（V）在早期静止期减少；天门冬氨酸（D）和谷氨酸（E）在静止期减少。由于大多数代谢物在指数期和早期静止期已经增加，其中细胞死亡可以忽略不计，因此代谢物浓度增加的主要来源是来自代谢活跃细胞的输出。

由于酵母细胞能有效感知和吸收胞外氨基酸，推测静止期的细胞可以吸收这些氨基酸。利用13C-葡萄糖同位素标记来测试静止期细胞对指数期产生的代谢物的消耗情况。在补充有12C或13C标记的葡萄糖的SM培养基（最低成分培养基）上培养野生型酵母细胞48小时，这个时间段可以确保培养基中的葡萄糖已经耗尽。然后在标记的和未标记的细胞之间交换培养基。同时，还设置了在补充有13C-葡萄糖标记的SM培养基上生长的对照细胞，将其换成只含氨基酸的SM培养基（没有葡萄糖），以区分细胞内氨基酸水平是直接输入氨基酸所致还是输入碳水化合物分解的中间产物导致。靶向定量检测细胞内氨基酸水平，结果表明，在12C-或13C-葡萄糖上生长的细胞中，细胞内含13C或12C的氨基酸水平分别增加，证实了细胞在指数期释放的氨基酸被静止期细胞吸收，酵母细胞在时序性衰老过程中建立了跨代际的代谢物交换相互作用（图1）。

图1. 酵母细胞建立跨代际代谢物交换的相互作用

由于代谢物从细胞中输出是代谢的基本属性，研究人员通过自建代谢交换工具（Self-establishing metabolically cooperating communities，SeMeCo）作为工具增加细胞间的代谢物的交换，来测试代谢物交换对CLS的影响。其中编码基本代谢酶的质粒分离在菌落形成过程中随机引入营养缺陷（代谢缺陷）。SeMeCo形成一个包含营养缺陷型的群落，该群落在专性代谢物共享的基础上作为一个群落生长；与工程代谢物共享群落相比，SeMeCo中的细胞没有改变生物合成途径，也未产生反馈抗性。相反，它们提高了细胞之间发生的代谢作用的数量。与野生型群落相比，SeMeCo的特点是代谢物输出总体增加，细胞外代谢物浓度增加。通过监测菌落形成单位（CFU）随时间的变化来分析SeMeCo的CLS，结果表明，与野生组相比，SeMeCo的寿命显著增加。为了对存活率进行独立评估，用活/死细胞染色法监测细胞存活率，结果表明，在后期的时间点，SeMeCo的活细胞更多。

结果还发现，酵母细胞在菌落中的存活时间比在液体培养中显著增加（65天对20天），SeMeCo的CLS仍比野生细胞显著延长，验证了代谢相互作用可以增加CLS；细胞在菌落中的相互靠近减少了细胞外代谢物的稀释，有利于代谢相互作用，结果显示，与野生组相比，SeMeCo中氨基酸和尿嘧啶的细胞外水平显著增加（图2）。

图2. 代谢物交换的相互作用延长酵母菌群落寿命

接下来，探究寿命的延长是否与特定的代谢途径有关。SeMeCo模型是基于四个质粒编码的营养缺陷的标志酶（HIS3、LEU2、URA3和MET15）的随机分离，产生16种代谢基因型，其特点是代谢和转录的差异。结果显示，所有代谢型的CFU数量减少，伴随着细胞活力的整体丧失，且在静止期未进一步增殖。而原始基因型细胞的相对比例随着时间而降低。在静止期后期，98%的存活细胞至少是一种代谢物的营养缺陷型。在营养缺陷体中，MET15分离体（MET15营养缺陷型）占主导地位。产生了额外的SeMeCo，其中只有三个标记分离（''''3p-SeMeCo''''），而第四个基因座被基因组修复。结果表明，MET15基因座不分离的3p-SeMeCo，其寿命显著缩短；而HIS3、LEU2或URA3的基因组修复并未显著改变寿命。相反，与野生型相比，仅分离出MET15标记的SeMeCo（pMET15-SeMeCo，也称为pM-SeMeCo）的寿命延长。已报道，甲硫氨酸的生物合成和相关的含硫中间产物与衰老有关，因为在模型生物中限制甲硫氨酸后寿命延长。然而，SeMeCo的细胞外介质比野生型细胞更富含氨基酸，表明在SeMeCo中寿命延长不是由甲硫氨酸限制介导。

随后，用20毫克/升的甲硫氨酸分别补充到野生型和met15突变细胞的培养液中。尽管甲硫氨酸水平很高，但met15突变细胞和分离出MET15质粒的SeMeCo的寿命显著延长；且与野生型群体相比，SeMeCo在SM培养基中的生长速度降低；而SeMeCo和MET15-SeMeCo的生长速度是相似的，因此寿命延长也不是由生长速度的差异所介导。

随后，将CLS实验与代谢分型分析相结合，发现寿命延长由旁分泌机制介导：不仅met15突变细胞的寿命增加，且met15突变细胞的存在也增加了群体中其他细胞的寿命，这表明，细胞外代谢物的变化是寿命延长的一个来源（图3）。

由于SeMeCo是一个实验室模型，随后探究自然界中甲硫氨酸营养缺陷体和原型营养体之间的相互作用是否频繁出现。根据地球微生物组计划中收集的>12,000个天然原核生物群落的宏基因组数据的营养缺陷预测，发现甲硫氨酸营养缺陷者的频率在所有氨基酸营养缺陷者（细菌和古细菌样本）中处于中间水平。在这些天然微生物群落中，67.9%至少包含一个预测为甲硫氨酸营养缺陷的物种，有些群落存在>40个甲硫氨酸营养缺陷的物种。

图3. SeMeCo的寿命延长由旁分泌机制所介导

为了探索介导寿命延长表型的细胞外在因素，使用代谢通量平衡分析（FBA）的群落适应模型模拟一个野生型和15种营养缺陷代谢型中的每一种之间的代谢物交换，这些代谢型是由HIS3、LEU2、URA3和MET15营养缺陷型的所有可能组合产生的。群落FBA结果显示，MET15营养缺陷型和met15突变细胞之间的相互作用导致广泛的代谢通量改变，尤其是中心代谢，以及甲硫氨酸以外的更多数量的代谢物的交换。通过扩大分析到其他氨基酸交换的相互作用来探究其普遍性，结果表明，代谢途径之间存在紧密的相互作用，且大量的代谢转换作用于甲硫氨酸途径的通量。

为了更深入地了解所涉及的途径，在时序性衰老的野生型群体和分离或不分离MET15标记的SeMeCo上进行蛋白质组学研究，共检测到1951个蛋白质。通过对不同群落的比较显示，大部分差异蛋白的表达发生在MET15营养缺陷型和met15突变细胞相互作用的时刻。GO功能富集分析显示，一半以上的差异表达的蛋白质属于代谢过程。通过iPath3将酶的表达水平映射到代谢网络图上，揭示了中央和中间代谢的变化。通路分析结果聚集到了糖酵解。在含有MET15分离体的群体中，糖酵解酶被上调。随后，在指数期和早期静止期培养物中进行耗氧量（OC）分析，以避免死细胞比例增加产生的混杂效应。与蛋白质组水平的糖酵解上调一致，在含有MET15分离体的群体中，OC降低（图4）。

图4. 蛋白质组和代谢组变化揭示糖酵解代谢的增加

糖酵解和糖酵解衍生物都与衰老有关。葡萄糖限制本身会延长寿命，而糖酵解衍生物乙醇和乙酸会缩短寿命，同时第三种代谢物甘油会增加CLS。在静止期，在MET15和met15突变分离体相互作用的群落中，乙醇、乙酸和甘油的水平显著增加。其中乙醇和乙酸的含量增加了2倍，甘油含量在静止期增加了8倍。为了解释甘油增加的来源，检测细胞内糖酵解代谢物，结果显示，在静止期，在MET15营养缺陷型和met15突变细胞相互作用的群落中，检测到与甘油有关的三个碳的磷酸（包括G3P和磷酸二羟丙酮[DHAP]）显著增加。进一步分析调控甘油生物合成的酶的表达，结果表明，高渗透性甘油1蛋白（Hog1p，涉及对渗透压反应的基因，包括甘油生物合成酶）在SeMeCo与野生型群体中显著上调。此外，甘油生物合成酶甘油-3-磷酸磷酸酶1和2（Gpp1p和Gpd2p）的表达也增加。

为了探究甘油的积累是否与寿命的延长有关，将细胞生长在补充了甘油的SM培养基中进行CLS试验。与之前观察到的野生型和MET15-SeMeCo的20天相比，补充甘油可将寿命延长至62天。虽然甘油的积累是有益的，但仅靠甘油的增加可能不足以反映酵母菌外代谢物的复杂性。为了验证群落的自我衍生的代谢物是否确实介导了生命期的延长，在SM培养基中培养野生型群落，直到早期静止期，然后将它们转移到SeMeCo组对应的培养基中。通过将野生型群落放回它们自己的细胞外代谢物来生成对照培养物。在从SeMeCo获得的细胞外代谢物上培养的野生型群落的寿命显著延长。因此，当MET15营养缺陷型和met15突变细胞相互作用时出现的代谢变化产生了一个有利于生存的代谢环境，延长了群体中所有细胞的寿命（图5）。

图5. SeMeCo的寿命延长由保护性代谢物介导

代谢和衰老有着密切联系，协调代谢的多种途径也是衰老和寿命的主要调节因素。作为甲硫氨酸生物合成途径的一部分，含硫氨基酸和相关的中间产物也是这种途径的关键角色，通过谷胱甘肽（GSH）和多胺的生物合成直接影响抗氧化反应。结果发现在SeMeCo和野生型群体之间，谷胱甘肽合成酶的表达增加。多胺的生物合成需要S-腺苷甲硫氨酸（SAM），这是甲硫氨酸生物合成途径的中间产物，也是生成精氨酸和精胺的底物。与野生型或MET15-SeMeCo在静止期相比，在SeMeCo中检测到的精胺和腐胺的水平增加。

蛋白质组数据显示，与指数期细胞相比，在早期静止期和静止期，AMPK的酵母同源物(SNF1)激酶及相关蛋白有所增加，但在野生型和SeMeCo之间未观察到显著改变。在CLS期间，与TOR活性有关的基因组在SeMeCo与野生型之间并未显著富集。相反，参与一般代谢过程的酶的表达，特别是氨基酸的生物合成酶，在蛋白质组水平显著上调。当细胞在保护性的衍生代谢物中生长时，多种代谢抗衰老因素，如抗氧化酶、抗氧化代谢物、多胺和甘油相关的促生存过程的蛋白表达均增加（图6）。

图6. 甲硫氨酸交换相互作用影响多种衰老途径

本研究通过观察酵母的时序性衰老，发现细胞间通过代谢物的交换来影响衰老。通过使用自建代谢交流工具（SeMeCo）增加细胞间的代谢物的交换，并观察到寿命的明显延长。SeMeCo的长寿归因于甲硫氨酸消耗导致细胞的代谢重构。这些细胞获得了更多的糖酵解代谢和释放的甘油，通过旁分泌效应和诱导延长寿命的代谢适应，包括增加抗氧化代谢物和多胺的水平，延长了甲硫氨酸生产者的寿命。本研究确立了代谢物交换的相互作用是细胞衰老的决定因素，并表明代谢交换的细胞可以塑造代谢环境以延长双方寿命，这一发现将对人类衰老过程和与年龄有关的疾病研究提供重要指导。

参考文献 

Cell-cell metabolite exchange creates a pro-survival metabolic environment that extends lifespan. Cell. 2023.

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