2023-02-13 09:36:45 Merck工艺解决方案
CHO等哺乳动物细胞培养是一个复杂且高度可变的过程,通常只有少数关键参数如温度、pH值和溶氧(DO)是实时控制的,但这些参数并不能直接指示细胞的生长状态。而关键工艺参数(CPP)如葡萄糖、乳酸或铵的浓度,以及关键性能指标(KPI)如总细胞密度(TCD)和活细胞密度(VCD)则直接表征了细胞的生长状态,但在传统工艺中这些参数的监测通常采用离线的方式,并非实时获取。如果借助专为生物工艺设计的拉曼分析仪,则可以实现在工艺开发阶段和生产阶段对CPP和CQA的在线和实时监测。
本应用案例介绍了应用ProCellics™拉曼光谱软传感器1实现CHO细胞灌流培养过程中CPP的在线和实时监控,该工艺细胞密度达到160 x 106 cells/mL。在相应光谱数据和生物工艺参数的多变量回归分析中,应用了偏最小二乘回归(PLS)2的方法。
拉曼技术
在介绍ProCellics™ 拉曼分析仪和 Bio4C™ PAT 拉曼光谱仪软件在CHO细胞灌流培养中的应用前,让我们首先来了解一下拉曼散射效应。所谓“拉曼效应”是指光通过介质时被介质散射后光频及相位发生改变的现象。而且频率的改变量与入射光频无关,而与散射物性质有关。例如,水(H2O)有三种不同的分子键振动,产生三种不同的拉曼位移(波长改变),则对应三种不同的拉曼信号。如下图所示,拉曼光谱表征了特定拉曼位移的信号强度(AU),从而区分不同振动模式的水分子。这样的分析方法也可应用于溶液中的其他物质(如培养基中的葡萄糖、乳酸等),因此拉曼光谱可以被比作分子指纹。
拉曼技术与PAT
过程分析技术(PAT)由FDA发起,旨在鼓励药物开发、制造和质量保证方面的创新。PAT的目标是通过实时监测和控制过程,将质量融入生物制药生产过程,使其更加稳健和透明。通过在指定的设计空间内识别和监测CPP和CQA,拉曼光谱可以了解细胞培养过程,并通过实时监测提高产品质量。
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ProCellics™在灌流培养中的应用实例
以下数据来源于CHOZN® GS细胞系表达的IgG1克隆在6次N-1培养中的测试结果,其中应用了CelliconTM细胞截留装置和一次性膜包,以及ProCellics™拉曼分析仪和Bio4C™ PAT 拉曼光谱仪软件,其工作流程如下图所示。
细胞培养工艺参数及拉曼传感器参数如下表所示:
在前期采样数据经过预运行后,利用5个批次的N-1细胞培养离线数据通过Bio4C® PAT Chemometric Expert软件进行葡糖糖、乳酸、铵、渗透压、VCD、TCD以及抗体浓度的PLS建模(样本数量为86-101个)。此后PLS校准模型被导入Bio4C® PAT拉曼光谱软件,用于直接集成、可视化和自动预处理传入的实时光谱数据,以监测工艺参数。另外一批独立的N-1细胞培养(n = 1批次,21个过程样品)用以进行模型验证。
PLS模型通过R2、Q2和RMSEcv的评估,其中R2>0.91,Q2>0.87,RMSE值也表明在预测过程中模型拟合良好3。从以下图表可见,在此案例中利用PLS多变量回归模型作为软传感器,对本研究选择的所有7种CPP进行了稳健的在线实时监测,其中平均预测相对误差仅3%,相对误差较大的铵为15%。
实时监测的众多优点之一是它能够连续测量过程参数,从而填补我们对过程的理解空白,尤其是在没有手动样品的时间点。如上图中B、C、D所示,实时监测可以捕捉到数据值升高和下降的全部过程,而离线监测则无法做到这一点。
可见,借助ProCellicsTM 拉曼分析仪和Bio4C® PAT拉曼软件,我们能够在线和实时的监测CHO细胞灌流培养的中的多个关键细胞培养变量,从而提高我们对灌流培养过程的理解。
拉曼光谱分析作为生物制药领域中实现PAT的有效工具,有诸多应用前景。如在上游培养工艺中进行氨基酸等成分的代谢分析,可进一步加深对细胞代谢过程的理解、优化补料和培养策略、为培养基开发提供有效的数据支持;而在下游工艺中,拉曼光谱也可以应用在纯化循环的监控、蛋白聚体等其他质量属性的实时监测中。可见通过拉曼光谱技术,对CPP和CQA进行在线和实时监控,有助于更好的满足下一代强化工艺对于产品质量的要求。
注释:
1. 软传感器,也称为软件传感器或虚拟传感器,可以用作根本无法测量或只能通过非常复杂的设备测量的过程变量的替代方案。他们使用一个或多个原始测量值以及经验或理论,有时也是动态模型,以便为生物过程提供有意义的信息。
2. 偏最小二乘回归(PLS),是一种将用于预测的变量简化为一组较小的预测变量的方法。这些预测变量会用于执行回归。
3. R2:决定系数。
Q2:交叉验证的变异系数
EMSEcv:交叉验证的均方根误差
ProCellicsTM拉曼分析仪
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