2023-02-09 17:36:11, JG ProteinSimple
来自Merck
溶瘤病毒(Oncolytic virus)疗法是一种新型免疫疗法,基于病毒在肿瘤中的感染和复制来杀死肿瘤细胞,并增强适应性免疫。该疗法通常使用的病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒、麻疹病毒和柯萨奇病毒(Coxsackievirus)。
2022年,Merck发表两篇文章利用全自动毛细Digital Western技术定量表征柯萨奇病毒(Coxsackievirus A21 ,CVA21) VP1、VP2、VP3、VP4和VP0,并探究纯化工艺对病毒颗粒影响。
柯萨奇病毒
CVA21是一种肠病毒,基因组为单链RNA(~7.4 kb),其衣壳是由60个蛋白亚基所组成的二十面体,直径为30 nm。
CVA21示意图片
CVA21绞杀癌症细胞机制是通过与癌细胞表面过表达受体(Intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1),即细胞间黏附分子-1相结合,上调其表达。ICAM-1在控制肿瘤恶化和转移的过程中起重要作用。CVA21的临床研究显示了其良好的安全性和靶向肿瘤细胞死亡的特性。
快速、准确及可量化表征病毒载体空/完整/部分完整的衣壳对于细胞培养、工艺开发、满足监管要求和验证生产过程至关重要。
鉴定表征
成熟病毒(Mature virion/Full particle)含有 VP1、VP2、VP3和VP4。未成熟病毒(Immature virion/Empty particle)仅含有VP0、VP1和VP3。
已组装的CVA21衣壳由原体(Protomer)和五聚体(Pentamer)组成。原体由VP1、VP3和前体蛋白(Precursor protein)VP0组成。5个原体组成一个五聚体。12个五聚体可组装成缺少RNA基因组的空壳颗粒(Procapsid/Immature virion),或者包含病毒RNA基因组前病毒体(Provirion),当VP0分裂成为VP4和VP2后形成成熟病毒(Mature virion)。
VP1代表总颗粒含量;VP4代表完整衣壳病毒;VP0代表未成熟病毒/空衣壳。通过VP0和VP4,可表征空壳与完整衣壳的相对比率。通过VP0和VP1,可表征空壳与完整衣壳的绝对比率。
CVA21原料药(DS)和药物产品(DP)的生产涉及多个单元操作,需在整个过程中表征总颗粒浓度以及空颗粒与完整颗粒的比率。在产品开发过程中,总颗粒浓度被用来量化细胞培养和下游纯化过程中产生的病毒颗粒的质量产量。只含有VP1、VP3和VP0(37.2 kDa)的非感染空壳颗粒被认为是与产品相关的杂质,其中大部分必须被去除。因此,DS和DP须被纯化为主要包含具有感染性的、成熟的、完整的颗粒,即由VP1、VP2、VP3和VP4组成,理论分子量(MW)分别为33.2 kDa、29.9 kDa、26.5 kDa和7.3 kDa。
文献已有报道使用如下几种方法表征非包膜病毒衣壳,如腺相关病毒(AAV)。酶联免疫吸附试验(ELISA)和高压排阻色谱(HPSEC)已被用于测定总AAV颗粒。同样,冷冻电子显微镜(Cryo-EM)、离子交换色谱(IEX)、分析型超速离心(AUC)、毛细管等电聚焦(cIEF)和质谱(MS)也已被用于表征完整与空AAV颗粒。类似的方法已被用于表征柯萨奇病毒A16。但是,定量表征CVA21蛋白和病毒颗粒的分析方法十分有限。研究人员曾使用高压排阻色谱/多角度光散射/折射(HPSEC/MALS/RI)定量总病毒颗粒,使用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)表征空壳率。但是,这两种方法不能在细胞培养收获样品和未纯化的中间体中进行,因为会受到培养基和宿主细胞碎片干扰。
Merck评价
自首次引入毛细管Western Blot技术(即全自动毛细管Digital Western技术,也被称为Simple Western)及其在疫苗应用中首次报道,该技术已成一种非常实用且重要的分析疫苗产品的工具,包括鉴定、浓度、酶动力学、稳定性和试剂筛选。
Merck研究人员指出,全自动毛细管Digital Western技术(Simple Western)是宝贵的分析工具,该技术可提供及时信息帮助指导下游工艺决策和优化。并且,该技术拥有更广泛的溶瘤病毒应用拓展,以及基因治疗领域中AAV相关应用。
结果展示
图1:全自动毛细Digital Western(Simple Western)表征CVA21 VP0、VP1、VP2、VP3和VP4;
图2:全自动毛细Digital Western(Simple Western)绝对定量VP0,即未成熟病毒/空衣壳;
图3:不同纯化步骤(Purification step, PS)后表征VP0和VP4;
Digital Western技术加速基因治疗
一站式探索多个关键质量属性
全自动毛细管Digital Western技术作为创新性毛细管电泳免疫学技术,此技术已被基因治疗和核酸药物领域领导者广泛采用,如Ionis Pharmaceuticals、Sarepta、pfizer、Regenxbio、Arcturus、MeiraGTx、Editas medicine、CRISPR Therapeutics、Alnylam、Dicerna、Arrowhead、Moderna、BioNtech、杭州嘉因生物、石药集团等。
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参考文献:
1. Andrew R. Swartz, et al. “Binding of Coxsackievirus A21 procapsids to immobilized glutathione depends on cell culture conditions during infection,” Virology, Volume 573, 2022.
2. Gillespie, Paul F et al. “Quantitation of Coxsackievirus A21 Viral Proteins in Mixtures of Empty and Full Capsids using Capillary Western.” Human gene therapy, 2022.
3. Chuan Xiao, et al. “The Crystal Structure of Coxsackievirus A21 and Its Interaction with ICAM-1,” Structure, Volume 13, Issue 7, 2005.
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