【环状RNA】中篇：合成和环化方法比较分析

化学合成

优势：RNA合成纯度高，方便定制化序列；

局限性：适用于长度在70-80bp的小片段RNA合成

体外转录IVT

优势：适用于长片段(~kb)的RNA合成；

局限性：由T7、T3或SP6 RNA聚合酶转录的线性RNA3’起始端第1个碱基通常需要是鸟苷酸G，5’末端通常会添加1-3个碱基的非模板序列；

解决方法：i) 将丁型肝炎病毒核酶序列（~67 个核苷酸长）附加到 DNA 模板的末端，这导致转录后在 3'' 末端进行精确的核酶切割，ii) 使用含有 2'' -O- 的 PCR 模板 其 3'' 端的甲基核苷酸，减少了 T7 的非模板核苷酸添加。

化学法

缩合试剂溴化氰 (BrCN) 或 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基) 碳二亚胺 (EDC) 常用于化学激活 的RNA 环化。

局限性：环化键不是磷酸二酯键，因此无法在化学上模拟体内的反向剪接位点。

连接酶

体外 RNA 的酶促分子内连接需要 RNA 在其 5'' 端包含单磷酸基团。这可以通过在 IVT 反应期间调节GMP 与 GTP 摩尔比或使用焦磷酸酶去磷酸化来实现。可以使用 T4 DNA 连接酶、T4 RNA 连接酶 1 或 T4 RNA 连接酶 2 实现单磷酸化 RNA 的酶促连接。赛默飞提供 T4 RNA 连接酶（货号AM2141或EL0021）的产品供大家选择。

局限性：连接酶法序列依赖性强，适用于环化较短的 circRNA（最多约 300 个核苷酸）。

核酶

核酶是具有类似蛋白质酶典型催化作用的 RNA。使用某些核酶序列形成了体外环化 circRNA 的第3种策略。目前最常用于环化RNA的核酶包括在细菌和真核生物的 rRNA、tRNA 和 mRNA 基因中自然发现的 Group I/II内含子。

优势：适用于长片段RNA环化（最多几千个碱基），序列依赖性弱，环化效率高，不需要额外的酶。特别的，Group II内含子核酶促进的环化可以实现体外转录共环化，RNA无残留序列。