色谱双峰大排查

色谱双峰指的是同一种物质，在色谱图中表现出双峰，让我们误以为是两种物质。那为什么会出现这种情况，在实验过程中又该怎么避免，今天小编就和大家一起来聊一聊。

在HPLC分析中，在色谱柱正常、样品浓度适宜、分析方法合适、色谱峰在出峰时间较短的情况下，峰形应是一个高斯峰型，对称而尖锐的。然而在实际操作中，如果对样品性质不了解，前处理不恰当或者分析方法不合理时，就会出现峰形不正常的情况，其中双峰现象是液相色谱常见的问题之一。出现色谱双峰的原因一般有以下几种：

如果在分析样品时发现每个色谱峰都是双峰，尤其是分析单一纯物质时，则可以确定是色谱柱出现问题了，一般是柱头受损引起的。如果进样量少，原来色谱峰正常，峰形多为一大峰带一小峰，不一定拖尾时，应考虑是柱头端被堵塞，可以将色谱柱反接（月旭的色谱柱可以反冲），用流动相或酸或其他有机溶剂冲洗，将堵在柱头端的物质冲掉后，再正接测试，通常会有改善。当然也可以不反冲，正冲有时也有效果。

如果双峰强弱相差不大，柱头端填料变脏或柱流失的可能性更大，这时可以把柱头拧开，将筛板取下超声，柱头端刮去被污染的填料，填上新填料后再拧紧，不过这个最好是由专业人员操作且不能经常做，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效降低而报废。如果上述操作仍不能解决问题，则可能是柱塌陷造成的，需要更换色谱柱。

目前HPLC分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加入各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解，最佳的溶解方法是用流动相溶解。在实际分析中，有时候为了样品的溶解性或稳定性加入了一定的缓冲液，缓冲液的酸碱性可能会导致样品转化，从而产生双峰现象。此时需要更换缓冲液，调整溶剂pH值，或者用流动相配置样品。

此外，样品要现配现用，避免因样品溶解液的有机相比例、pH值发生变化而导致的溶剂效应。

当用溶剂极性强度大的试剂溶解样品，如甲醇、乙腈、乙醇等，而分析体系以水为主时，如果样品进样量大，比如进20μL，此时目标物会出现双峰，第二峰比第一峰小(每次都不太一样)，且拖尾，保留时间会提前(相对进样量少而言)，将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的，这种情况下需要减少进样量或者用流动相溶解样品。

另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾(如果出峰很快，也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。

体系pH值对色谱双峰的影响出现在各个环节上，尤其在缓冲液流动相平衡过程中其影响更为明显。当连续进样时，受pH的连续变化影响会经常遇到这种双峰的情况。另外，在样品分析时，流动相的pH尽量远离被分析物的等电点，否则也容易引起产生双峰。在用离子对试剂分析时，液相条件没选择好也会引起双峰。

有些样品由于其化学结构的特点，存在异构体。有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在LC-MS下，其质谱的总离子流图（TIC）上较明显，如啶虫脒。

参比波长设置错误，例如设置分析波长254nm，参比波长400nm，这个对于大多数化合物可能没影响。但是如果被测化合物，在400nm处也有强的紫外吸收，比254nm更高。这样其出峰时，由于背景的抵扣作用，本来一个峰会变成对称的二个峰，而且如果将二峰之间的峰谷反转180度，恰好是一个完整的峰。这时要将参比波长设置更大，或者取消。

当然，如果仪器存在较大死体积，也可能会导致双峰出现。

在对样品不够了解，分析方法不当，样品处理方法及进样方式不合理情况下，会出现各种意想不到的问题，也很难对色谱峰作出合理的解释，尤其对于新手更是如此，所以，了解每种异常出现的原因，并根据原因采取合理的改进措施，是避免异常峰出现的最有效的办法。