New Phytol | 北京农学院姚允聪团队再发miRNA调控苹果花青苷机制成果

1.实验分组/研究材料

（1）套袋组（黑暗处理，对照）：采后套袋苹果。

（2）弱光处理组（处理一）：采后套袋苹果，去除袋子，用硫酸盐纸袋包装。

（3）强光处理组（处理二）：采后套袋苹果，去除袋子。

（4）处理时间：在处理后0、2、4、6和15 d，取树周大小相近的苹果果实果皮进行取样。

2.技术路线

2.1 转录组和miRNA组分析：取光照处理2 d的苹果果皮样品进行转录组和miRNA组测序。

2.2 花青苷和木质素含量分析：测定对照组，处理一和处理二苹果果皮花青苷和木质素含量。

2.3 基因相对表达量变化分析：计算木质素和花青苷代谢通路关键基因在对照组，处理一和处理二中的相对表达量。

2.4 miR7125靶向MdCCR关系分析：5‘RACE

2.5 miR7125和MdCCR功能分析：农杆菌瞬时表达苹果

2.6 miR7125启动子功能分析：生物膜干涉技术Biolayer interferometry (BLI)

1. 不同光强处理后苹果果实颜色的表征

如图1所示，光照处理显著促进苹果果皮花青苷积累，且积累量随光强增加而增加，木质素含量则随光强增加而减少。光照处理下，苹果中花青苷合成关键基因MdC4H，Md4CL, MdCHS, MdF3H, MdF3’H, MdDFR1, MdANS, MdUFGT的相对表达量随光强增加而增加；而木质素合成关键基因MdCCoA-OMT, MdF5H, MdCAD, MdCOMT和MdCOMT2相对表达量随光强增加而减少。

2. 不同光强处理下苹果花瓣、叶片、绿皮、果肉和果皮中miR7125和MdCCR表达水平的qRT-PCR分析

如图2所示，随着光照强度增加，mdm-miR7125相对表达量显著升高，MdCCR（肉桂酰辅酶A还原酶基因）的相对表达量显著降低。随着苹果花从芽到盛花发育阶段，花青苷含量逐渐降低，mdm-miR7125相对表达量显著降低，MdCCR的相对表达量显著升高。mdm-miR7125和MdCCR在苹果叶的表达量显著高于绿色表皮和果肉。

3. 苹果果实中miR7125和MdCCR表达的鉴定

如图3所示，RLM-RACE结果表明MdCCR是miR7125的直接靶标，其裂解位点位于互补区域内的第4和第5碱基之间(图3a,b)。MdCCR基因的CDS，全长648 bp，编码215个氨基酸(与金香苹果中已发表的MdCCR序列一致)，包含3个保守基序，包括CCR超家族的碳域和硫氧还蛋白超家族的氮域(图3c,d)。如图3(e)结果显示， PbCCR与MdCCR关系密切，一致性为98%。

4. 在摘袋后的套袋苹果中过表达mdm-miR7125和干扰MdCCR功能分析

如图4所示，在收获的套袋苹果摘袋后，分别过表达mdm-miR7125，干扰MdCCR表达，以及同时过表达mdm-miR7125和干扰MdCCR表达，苹果表皮花青苷显著积累，木质素含量显著下降。在这三种处理条件下，MdCHS等花青苷合成关键基因显著上调表达，MdF5H等木质素合成关键基因显著下调表达。

5. 在摘袋后的套袋苹果中干扰mdm-miR7125和过表达MdCCR功能分析

如图5所示，在收获的套袋苹果摘袋后，分别干扰mdm-miR7125表达，过表达MdCCR，以及同时干扰mdm-miR7125表达和过表达MdCCR，苹果表皮木质素显著积累，花青苷含量显著下降。在这三种处理条件下，MdCHS等花青苷合成关键基因显著下调表达，MdF5H等木质素合成关键基因显著上调表达。

6.MdMYB16和MdMYB1能够结合mdm-miR7125的启动子

如图6所示，套袋苹果摘袋后，MdMYB16的表达量随光强增强而显著降低；MdMYB1的表达量随光强增强而显著升高。相关性分析表明，MdMYB16与木质素，花青苷，mdm-miR7125和MdCCR呈显著负相关关系；MdMYB1与木质素，花青苷，mdm-miR7125和MdCCR呈显著正相关关系。生物膜干涉技术Biolayer interferometry (BLI)结果表明，MdMYB16和MdMYB1主要结合在mdm-miR7125启动子的“CAACAG”元件（MYB结合位点，MBS）位置。

7.在摘袋后的套袋苹果中过表达和干扰MdMYB16功能分析

如图7所示， 在收获的套袋苹果摘袋后，过表达MdMYB16，苹果表皮木质素显著积累，花青苷含量显著下降；其中，MdCHS等花青苷合成关键基因显著下调表达，MdF5H等木质素合成关键基因显著上调表达。在收获的套袋苹果摘袋后，干扰MdMYB16表达，苹果表皮花青苷显著积累，木质素含量显著下降；其中，MdCHS等花青苷合成关键基因显著上调表达，MdF5H等木质素合成关键基因显著下调表达。

8. MdMYB16/MdMYB1-miR7125-MdCCR模块调控苹果光诱导过程中花青素和木质素生物合成的内稳态

如图8所示，光照条件下，苹果表皮中MdMYB1表达量升高，MdMYB16表达量下降，使更多的MdMYB1结合在mdm-MIR7125的启动子MBS元件上，从而激活mdm-miR7125的表达使其表达量升高，进一步靶向降解木质素合成关键基因MdCCR，最终降低苹果果皮中木质素的合成，促进花青苷积累。黑暗条件下，苹果果皮细胞中MdMYB16表达量升高，直接导致mdm-miR7125的表达量降低，MdCCR表达量升高，最终导致木质素含量升高，花青苷合成通路被抑制。

原文链接：

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.17431

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排版人：小久

原创声明：本文由欧易生物(OEBIOTECH)学术团队报道，本文著作权归文章作者所有。欢迎个人转发及分享，未经作者的允许禁止转载。