NC | 南京大学医学院附属口腔医院泥艳红/胡勤刚/丁亮团队发现口腔鳞癌复发新机制

口腔鳞癌（OSCC）是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，主要发生于舌部、口底部、牙龈、颊黏膜等部位，具有高复发性和转移性。早期OSCC患者（T1-2N0M0）采取以手术切除为主的治疗，但仍有20%~40%的患者术后出现局部复发、隐匿性淋巴结转移，因此，常规临床TNM分无法有效区分此类患者，且其复发和转移的原因及机制仍不明。

2022年8月31日，南京大学医学院附属口腔医院泥艳红、胡勤刚、丁亮团队在Nature Communications (IF: 17.694) 杂志上在线发表题为〝OXTR^High stroma fibroblasts control the Invasion Pattern of Oral Squamous Cell Carcinoma via ERK5 Signaling〞的研究论文，在口腔鳞癌（OSCC）复发的机制方面取得了重要进展，发现了一种新的调控肿瘤浸润方式的成纤维细胞亚群，并提出了通过靶向此亚群来改变肿瘤浸润方式的策略，为减少肿瘤患者转移和复发肿瘤提供了新的治疗思路。

1、WPOI亚型转换与OSCC进程密切相关

研究中共纳入880 OSCC患者，包括早期和晚期患者。发现OSCC患者中存在5种POI亚型，其中WPOI 4-5与更严重的肿瘤侵袭相关，而WPOI 1-3更易发生在早期（图1）。此外，WPOI 4-5患者的肿瘤细胞表现出显著的间充质表型，其中36%的WPOI 4-5患者更倾向于发展为晚期OSCC，16%更容易发展为早期OSCC。而WPOI 1-3患者表现出相对较高的无复发生存期（早期 84% 与晚期 74%）和总生存期。Cox regression分析表明：WPOI是OSCC低生存率的一个重要预后因子（图1）。因此作者推测POI的异质性可归因于间质的复杂性和异质性，最终引起了OSCC患者的术后预后不同（图1）。

2、基质成纤维细胞参与了WPOI亚型转换    

为了研究WPOI 1-3和WPOI 4-5亚型间的间质特征差异，采用IHC评估不同的基质细胞。collagen-I表达的基质细胞在WPOI 1-3和WPOI 4-5亚型中表现出了显著不同。由于基质成纤维细胞是负责在肿瘤微环境中产生胶原蛋白的关键细胞类型，因此作者独立收集了150 名OSCC患者检测其α-SMA的表达，发现α-SMA在WPOI 4-5亚型中相对较高（图2）。从WPOI 1-5亚型中分别分离CAF细胞系用于后续研究，发现CAF^{WPOI 4-5}的基质重构能力相对更强，而且可以显著提高OSCC上皮细胞HSC3对CAF重构基质的侵袭能力、促进类器官增殖等（图2）。体内验证证明CAF^{WPOI 4-5}可以加速肿瘤生长和转移（图2)。综上所述，CAF^{WPOI 4-5}参与了WPOI 4-5型肿瘤的侵袭和转移这一调控过程。

2、CAF WPOI 4-5亚型中OXTR高表达   

通过转录组测序发现神经元发育相关基因(RELN, MYH10, CACNB4, OXTR, CAV3, CHRM2等)、炎症相关基因(RELN, IL21R, EDNRB, CAV3, OXTR等)和OXTR在CAF^{WPOI 4-5}中显著上调表达，因OXTR基因在相关研究中已有报道，因此将其作为后续研究的一个关键候选基因。定量发现WPOI 4-5的OXTR 表达增加，此外乳腺癌和胰腺癌分离的CAFs细胞系中OXTR表达也有所增加（图3）。此外免疫组化显示，OXTR在CAF^{WPOI 4-5}的间质成纤维细胞中富集，且80%以上WPOI 4-5患者的间质OXTR高表达（图3）。有趣的是，中度至高度 OXTR+ CAF 的 OSCC 患者预后不良的风险非常高。

4、OXTR缺失会损害ECM重建和肿瘤侵袭

为了探究OXTR表达在CAF ^{WPOI 4-5}依赖的OSCC肿瘤侵袭中的作用，通过转录组分析了高或低OXTR水平的OSCC患者衍生的CAF中的基因表达情况，通路富集分析发现OXTR高表达与细胞粘附和ECM重塑密切相关，GSEA分析结果也与其一致。此外，OXTR^High CAFs细胞中PDGFRB和CDH2表现出高表达（图4）。为了进一步研究基质细胞可塑性的控制，在超低粘附环境中将HN6 OSCC细胞系与OXTR^High或 OXTR^low CAF共培养，发现类器官的增殖和形成异型球状体的能力依赖于OXTR^High CAFs的存在。在体内，发现与共同注射OXTRHigh CAF和HN6细胞的小鼠具有更显着的肿瘤负荷和淋巴结转移显著增加（图4）。为了研究OXTR在OSCC中的作用，建立s100a4-cre^- Oxtr-条件敲除小鼠模型，结果表明成纤维细胞OXTR的缺失可以显著抑制淋巴结迁移（图4）。

5、OXTRHigh CAFs衍生的趋化因子CCL26诱导CCR3+肿瘤细胞的间充质表型

蛋白芯片检测表明7个细胞因子（CXCL6, CCL26, CCL18, IL-1β, CCL7, CCL5, and TNFSF14/LIGHT）在OXTR^High CAFs中显著上调表达，而OXTR的缺失抑制了除CXCL6外的6个细胞因子的表达。与之前结果类似，CCL18、CCL26和LIGHT在促进OXTR^High CAF诱导的HN6侵袭方面具有最显着的效果，但仅敲低 CCL26损害了OXTRHigh CAF依赖性肿瘤侵袭。因此，OXTR^High CAFs中的CCL26具有相对优越的促进肿瘤侵袭的能力，然而敲除CCL26受体CCR3也能够抑制肿瘤侵袭（图5）。在HNSCC患者中，CCR3表达上调且EMT通路相关基因也显著升高（图5），这更证明了OXTR^High CAF来源的CCL26是CCR3+肿瘤复发的一个危险因素。

6、激活的ERK5对于OXTR^High CAFs的表型和功能维持是必不可少的

saRNA(Small activating RNA) 可以通过RNA干扰机制内源性和选择性地增强基因转录，并已开发用于临床。为了探索saRNA作为控制内源性OXTR基因表达的作用，作者设计4个靶向OXTR基因启动子的候选saRNAs，其中sa-OXTR-4可以促进CAFs中OXTR转录和翻译（图6）。此外发现CCL26基因在sa-OXTR组中更容易获得，在sa-OXTR组中发现更多激活的核ERK5，且OXTR^High CAFs中的总ERK5水平和核磷酸化ERK5（p-ERK5）水平升高，而敲除ERK5会显著抑制OXTR^High CAFs激活的CAF信号以及CCL26和OXTR的转录翻译（图6）。用JASPAR数据库预测了OXTR和CCL26启动子中c-myc的潜在结合位点，这些结合位点突变会强烈抑制OXTR和CCL26启动子的转录活性（图6）。

7、抑制ERK5可减弱OXTR^High CAF的促侵袭作用

通过敲除sa-OXTR CAFs中ERK5探究ERK5抑制对WPOI 4-5亚型肿瘤的治疗潜力，研究表明敲除ERK5有助于降低肿瘤的增殖和侵袭，且只有敲低ERK5才能通过降低LNM的发生率和肿瘤间充质表型来克服纤维增生间质（图7）。WPOI 4-5患者间质成纤维细胞的核ERK5和CCL26表达显著升高，且间质成纤维细胞中OXTR表达与ERK5的激活和CCL26表达显著相关，表明OSCC患者的生存率较差（图7）。综上所述靶向ERK5的转录激活活性有望成为治疗WPOI 4-5亚型肿瘤的一种有效治疗策略。

8、OSCC中的催产素对POI shift无影响

虽然OXTR^High CAF可以在体外以不依赖配体的方式发挥其功能，但作者希望探索OXTR配体OXT和AVP在患者中是否可能发挥作用。为了评估这一点，收集两个OSCC队列，OSCC患者的血清OXT水平随肿瘤进展显著升高，而WPOI 1-3和WPOI 4-5血清中OXT和AVP水平相当。OXT表达水平与患者生存时间无显著关联，且其浓度与核ERK5的活性无关。OXT和AVP水平与临床TNM分期、淋巴结转移和术后转移都没有关系，都不影响CAFs的侵袭。这些结果表明，OSCC患者中WPOI型的发展与其外周血OXT/AVP水平无关。

本研究发现，WPOI是早期OSCC患者术后复发的重要影响因素，WPOI 4-5患者的生存时间明显缩短，且术后出现淋巴结转移的可能性更高，与晚期OSCC的间充质表型相关，同时发现CAFs可能是促进不同WPOI分型的重要因素，进一步实验发现，OXTR通过激活核ERK5转录信号，以维持OXTR和CCL26高表达。ERK5敲低则会影响OXTR^High CAFs侵袭表型。因此，靶向OXTR^High CAFs中靶向ERK5信号是WPOI 4-5 OSCC患者的一种潜在的治疗策略。

南京大学医学院附属口腔医院丁亮副研究员为文章第一作者，并在致谢中特别感谢上海欧易生物周旋为本文提供的生物信息学的分析服务。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-32787-y

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排版人：小久

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