2022-11-16 16:43:33, 月旭科技 月旭科技(上海)股份有限公司
(图片来源:包图网)
离子交换作用
离子交换剂由不溶性高分子基质、荷电功能基团和与功能基团电性相反的反离子组成,在水溶液中,与功能基团带相反电荷的离子 (包括缓冲液中的离子、蛋白质形成的离子)依靠静电引力能够吸附在其表面。这样,各种离子与离子交换剂结合时存在竞争关系。
无机离子与交换剂的结合能力与离子所带电荷成正比,与该离子形成的水合离子半径成反比。也就是说,离子的价态越高,结合力越强,价态相同时,原子序数越高,结合力越强。在阳离子交换剂上,常见离子结合力强弱顺序为:
Li+< Na+<K+ <Rb+ <Cs+
Mg2+ <Ca2+ <Sr2+ < Ba2+
Na+ <Ca2+ <AI3+ <Ti4+
在阴离子交换剂上,结合力强弱顺序为:
F- < Cl- <Br- <I-
对于蛋白质这样带电荷的生物大分子,与离子交换剂的结合能力首先取决于溶液pH,它决定了蛋白质的带电状态,然后是蛋白质的色谱相关区域,也就是电荷在蛋白质表面的分布情况,这些在前面都已经提到。此外,还取决于溶液中离子的种类和离子强度。溶液中的无机离子和蛋白质竞争性的与交换剂结合,在起始条件下,溶液中离子强度较低,上样后由于蛋白质带电荷数较多,与交换剂之间结合能力更强,因此能取代离子而吸附到交换剂上;在进行洗脱时,往往通过提高溶液的离子强度,增加了离子的竞争性结合能力,使得蛋白质样品从交换剂上解吸,这就是离子交换色谱的本质。
pH和离子强度I的影响
pH和离子强度I是控制蛋白质离子交换行为、分辨率、回收率等的重要因素。
pH决定了蛋白质以及离子交换剂的带电荷情况,因而是决定蛋白质是否发生吸附的最重要参数。在进行分离时,应当控制pH使得蛋白质和离子交换剂带相反的电荷,这里涉及两个方面。一方面,离子交换剂有一个工作pH范围,在此范围内能够确保离子交换剂带充足的电荷。通常,阳离子交换剂应用时有一个pH下限,低于此pH会有很大一部分离子交换基团失去负电荷而不再能结合阳离子;而阴离子交换剂应用时有一个pH上限,高于此pH会有很大一部分离子交换基团失去正电荷而不能再结合阴离子。另一方面,溶液的pH直接决定了蛋白质带电荷的种类和数量,选择适当的pH,能够保证目的蛋白分子与离子交换剂带相反电荷而被吸附,同时如果pH距离蛋白质的等电点过远,则造成蛋白质与离子交换剂结合过于牢固而不易洗脱。
在选择操作pH时还需特别注意目的蛋白的pH稳定范围,若超出此范围会造成蛋白质活性丧失,导致回收率下降。特别是由于道南效应,离子交换剂表面pH与溶液pH是不一致的。在阳离子交换剂表面的微环境中,H+被阳离子交换基团吸引而OH₋离子被排斥,造成交换剂表面pH比周围缓冲液中低1个pH单位;而阴离子交换剂表面的微环境中,OH₋被阴离子交换基团吸引而H+离子被排斥,造成交换剂表面pH比周围缓冲液中高1个pH单位。例如:某种蛋白质在pH=5时被阳离子交换剂吸附,实际上该蛋白质在交换剂表面是处在pH=4的环境中,若此蛋白质在此pH条件下不稳定就会失活。大多数蛋白质在pH=4以下稳定性都会下降而使回收率降低。
由于溶液中的其他离子与蛋白质竞争结合到离子交换剂上,因此离子种类和离子强度I是影响蛋白质结合和洗脱的另一重要因素。在低的离子强度I条件下,蛋白质通过荷电基团结合至离子交换剂上带相反电荷的功能基团上;当竞争离子浓度即离子强度I逐渐升高时,蛋白质逐渐被置换下来。对于带有特定电荷数的蛋白质,需要多高的盐浓度才能将其从离子交换剂上洗脱下来,并没有一个固定的规律,需要从实验中摸索。绝大多数蛋白质在1mol/L的盐浓度下能够被洗脱,因此在探索条件阶段,人们常把洗脱盐的终浓度定为1mol/L。事实上在溶液中盐类还常扮演稳定蛋白质结构的角色,为防止蛋白质发生变性或沉淀,离子强度不宜太低。另外,离子的类型也是一个重要因素,不同离子从交换剂上将蛋白质置换下来的能力是不同的,并且离子类型还对分辨率和不同蛋白质的洗脱顺序会产生影响。
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