项目文章 | 中医药研究！南京中医药霍介格、陈兆国团队喜发复方肠泰治疗肠道菌群紊乱与血清代谢组研究成果

2022年5月，南京中医药大学霍介格、中国农业科学院上海兽医研究所陈兆国团队（一作：蔡梦梦）联合在Frontiers in Pharmacology期刊（IF：5.988）发表了题为“Disordered Gut Microbiota in Colorectal Tumor-Bearing Mice Altered Serum Metabolome Related to Fufangchangtai”的研究成果，通过血清代谢组的研究方法，探究了FFCT作用的机理，描绘了小鼠微生物菌群影响图谱。为探讨肠道微生物群（GM）与血清代谢的关系提供了理论依据。

结直肠癌（CRC）是一种影响结肠或直肠的癌症。尽管由于人口筛查和内镜监测，CRC患者的死亡率正在稳步下降，但就发病率和死亡率而言，CRC仍然是世界上第三高的。肠道微生物群（GM）一旦失去平衡，就会导致一些系统性疾病的发生。许多证据表明，CRC的发展与GM生态失调之间有很强的相关性，CRC治疗的方法有很多，包括根治性手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等，但由于这些方法都有局限性，并会造成许多副作用。由于中药的协同和衰减作用，在预防肿瘤复发和转移方面起着不可或缺的作用。

根据临床经验，处方复方肠泰（FFCT）通过增强免疫系统、提高患者生活质量、减少副作用已被证明具有抗肿瘤作用。尽管GM可以与中药成分进行复杂的互动，但是否会影响中药对结直肠癌的疗效仍然是未知的。因此，作者以FFCT作为中药处方模型，探讨了中药治疗中转基因与中药代谢的相关性。

1.实验材料

人参、猕猴桃、红芪、枳实、薏苡仁、苦参等六种中药颗粒剂制备FFCT。

2.肠道微生物群检测实验

(1)实验分组

PBS组：正常小鼠注射PBS并给予ddH2O

CT26组：CRC荷瘤小鼠给予ddH2O

CT26L组：CRC荷瘤小鼠服用0.65 mg/g FFCT

CT26M组：给予1.3 mg/g FFCT的CRC荷瘤小鼠

CT26H组：给予2.6 mg/g FFCT的CRC肿瘤小鼠

(2)技术路线

给药前，皮下接种CT26-LUC细胞到小鼠侧翼（CRC荷瘤组），同时皮下接种PBS（PBS组）。PBS组和CT26组服用约ddH2O，其他组通过灌胃方式服用FFCT混悬液，并服用药物4周。给药27天后收集小鼠粪便样本和分离血清样本。

3.复方长泰血清代谢组学实验

(1）实验分组

对照组：正常小鼠注射PBS并给予ddH2O

CT26组：CRC荷瘤小鼠给予ddH2O

CT26H组：给予2.6 mg/g FFCT的CRC荷瘤小鼠

CM组：给予PBS并给予2.6 mg/gFFCT的正常小鼠

(2)技术路线

给药前，皮下接种CT26-LUC细胞，皮下接种于小鼠的侧腹(CT26组和CT26H组)，同时皮下接种PBS(对照组和CM组)。CT26H组和CM组灌胃FFCT混悬液，给药持续4周。从小鼠的眼球中抽取血液，收集上清液并储存在干冰中用于血液质谱分析。

4.粪便微生物移植实验

(1)实验分组

将小鼠随机分为两组：FMT-CA-FFCT组（移植CRC患者粪便的小鼠）和FMT-H-FFCT组（移植健康对照组的粪便）。

(2)技术路线

在进行灌胃之前，所有小鼠均在水中用广谱抗生素混合物2周。这两组患者分别灌胃CRC患者或健康人的粪便悬浮液2周（每周两次），同时灌胃FFCT（2.6 mg/g）2周。在最后一次口服给药24小时后，从小鼠眼球中提取血样，并储存在−80°C，直到分析。

1、复方肠泰调节CD4+和CD8+T细胞水平

FFCT治疗对各组肿瘤体积无显著影响（p>0.05），作者使用流式细胞仪分析了免疫细胞（CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞）的水平。结果表明，与CT26组相比，FFCT治疗组脾脏和血液中的CD3+CD4+T细胞显著增加，但两组之间的肿瘤体积没有显著差异。与CT26组相比，CT26H组脾脏的CD3+CD8+T细胞增加，但两组之间的血液和肿瘤没有显著差异。这些结果表明，FFCT可能通过提高血液和脾脏中CD3+CD8+和CD3+CD4+T细胞的水平来增强机体免疫力。

4.结直肠癌患者肠道菌群失调对复方肠泰代谢产物的影响

结直肠癌荷瘤小鼠的GM紊乱改变了与FFCT相关的血清代谢组。然而，在血清代谢组变化中起关键作用的肠道微生物群或肿瘤尚不清楚。FMT-CA组和FMT-H小鼠使用高剂量的FFCT（2.6 mg/g）比较两组之间的血清代谢，不包括肿瘤因素。PCA图和代谢物强度分布框表明样品相对稳定。如OPLS-DA图所示，两组的样本被清楚地分离，表明两组之间存在一定差异。FMT-H-FFCT组的血清代谢物包括尿酸、茉莉酸、间香豆素酸、胆酸、熊果酸、鹅去氧胆酸、γ-谷氨酰酪氨酸和一些氨基酸高于FMT-CA-FFCT组。结合网络检索，茉莉酸和间香豆酸与中医药有关，表明肠道微生物群可以作为单一因素影响FFCT的代谢。

5.复方肠泰对荷瘤小鼠肠道微生物的改善作用

荷瘤组和健康组的GM和FFCT的血清代谢有很大差异。GM在荷瘤小鼠体内的失调与FFCT相关的血清代谢物较少相对应。微生物16S rRNA基因测序用于检测不同剂量的FFCT对荷瘤小鼠GM的影响，发现FFCT治疗组（CT26L、CT26M、CT26H）的GM组成不同。FFCT治疗组的肠道微生物群落差异性高于CT26组。FFCT治疗组的厚壁菌丰度高于肿瘤组，这与健康组的趋势相似。此外，随着FFCT浓度的增加，厚壁菌的丰度降低。相反，FFCT治疗组的拟杆菌丰度低于肿瘤组，这也显示出与PBS组相似的趋势。CT26M组的拟细菌丰度最低，变形杆菌和放线杆菌丰度最高。

本文通过肠道微生物群检测实验、复方肠泰血清代谢组学实验、粪便微生物群移植实验三个实验以及流式细胞术分析、血清代谢组学分析、肠道微生物群分析、统计分析四个分析发现荷瘤小鼠GM的生态失调降低了与FFCT相关的血清代谢产物，FFCT可以纠正结直肠荷瘤小鼠GM的紊乱，发挥作用。CRC负荷下的转基因生态失调阻断了FFCT的吸收和代谢，说明更健康的肠道微环境有利于FFCT更好的疗效。此外，FFCT还可以纠正CRC个体GM的失衡。本研究通过结合肠道微生物群和血清代谢为FFCT的治疗效果提供了新的视角，为改善CRC患者的GM状态提供了基础，以获得更好的疗效。

参考文献

1.Abreu, M. T., and Peek, R. M. (2014). Gastrointestinal Malignancy and the Microbiome. Gastroenterology 146 (6), 1534–e3.e1533. doi:10.1053/j.gastro.2014.01.001

2.Lin, L., Trabi, E. B., Xie, F., and Mao, S. (2021). Comparison of the Fermentation and Bacterial Community in the colon of Hu Sheep Fed a Low-Grain, Non-pelleted, or Pelleted High-Grain Diet. Appl. Microbiol. Biotechnol. 105 (5), 2071–2080. doi:10.1007/s00253-021-11158-5

原文链接：

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fphar.2022.889181/full

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杨杨得亿、碎碎唸〆方方面，！、南玦|撰文

小久|排版

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