2022-10-26 22:42:20, ProteinSimple ProteinSimple
活化素(Activin)属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员,而调控活化素受体(Activin Receptor,ActR)的融合蛋白ActRIIA-Fc 和ActRIIB-Fc已被阐明具有刺激红细胞生成的潜力,因此他们已被世界反运动禁药机构(World Anti-Doping Agency,WADA)机构列入到禁药清单中。最近批准用于治疗输血依赖型MDS和乙型地中海贫血的药物Luspatercept就是这一类融合蛋白,这意味着它可能由于这一特性从而在体育运动中被滥用。
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来自法国国家科学研究中心的研究人员近期在《Drug Testing and Analysis》上发表了关于检测此类药物的文献。针对此类兴奋剂,他们使用Digital Western技术开发出了一种快速灵敏、特异性高又可重复的检测方法。实验证实,对于ActRIIA-Fc 和ActRIIB-Fc 纯溶液分析的LOD值低于SDS-PAGE和传统Western Blotting方法。此外该方法不仅可应用于血液样本,还同时可应用于血清样本、血浆样本和干血点兴奋剂检测样本(Dry Blood Spots,DBS)。研究人员还通过直接注射药物来获取样本的方式来检测这两类融合蛋白,实验结果也证实该方法可应用于日常检测。
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样本量要求更低,结果更精准
使用Digital Western技术平台(Simple Western),ActRIIA-Fc 和ActRIIB-Fc分子量分别是78kDa和84kDa,而药物Luspatercept的分子量为82kDa,Sotatercept的分子量为76kDa。将每孔上样量固定为5μL时,研究人员通过线性稀释方式,调整两种蛋白的含量,由50pg下调到0.39pg,测得两者的最低检测剂量分别为1.56pg和3.12pg。
此外,前期研究的样品量起始体积约为50-300μL,本研究中所有的血清和血浆样本检测的初始体积取了中位数100μL。因为体积上升至200-500μL时,检测的灵敏度并不会提升。实验结果显示,ActRIIA-Fc在血清样本中LOD值为0.1ng/mL,而ActRIIB-Fc是0.05ng/mL。
研究人员还测试了干血点兴奋剂检测技术(Dry Blood Spots,DBS),这项技术对运动员比较友好,价格不昂贵,也方便样本的运输。结果显示,ActRIIA-Fc在3.12ng/mL的浓度下就可以被检测到,ActRIIB-Fc在1.0ng/mL可被检测到。
总体来看使用Digital Western技术的LOD值比以往的SDS-PAGE、SAR-PAGE、IEF和质谱技术平台都要更低,灵敏度更高。
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可靠的方法验证
为了验证方法的特异性,也确认来自互相作用的信号不会干扰2种样本的测试结果,研究人员还检测了10个血浆和10个血清的样本。每次检测都添加内参,并控制样本浓度为1.0ng/mL和2.0ng/mL。结果显示,从血浆和血清提取出的ActRIIA-Fc 和ActRIIB-Fc没有互相干扰的信号。为了进一步验证该方法,研究人员还测试了浓度范围为0.2-2.5ng/mL的ActRIIA-Fc 或ActRIIB-Fc,测得的CV值分别为16.4%和11.5%。
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更便利的检测方式
除了使用BAF339和BAF340这两种抗体外,研究人员还测试了其余10种商业化蛋白抗体的结合情况。结果显示,EP7407可以特异性结合ActRIIA-Fc,而MAB3392、DPAB-L21507和A0856-10B和ActRIIB-Fc的结合情况也很好。这拓宽了在实际检测中的便利性。
4总结
①此类兴奋剂检测使用Digital Western技术LOD值比以往的SDS-PAGE、SAR-PAGE、IEF和质谱技术平台都要更低,灵敏度更高。使用该方法,6-7小时就可以完成20个样本的检测。
②该方法不仅可应用于全血样本,还同时可应用于血清样本、血浆样本和DBS样本。同时,抗体不限定于使用一家公司,提高了检测的便利性。
③该研究提示Digital Western技术用于日常的兴奋剂检测,用于融合蛋白检测可能存在巨大潜力。
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解锁Digital Western资料
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参考文献:
①Desharnais P, Naud JF. Detection of activin receptor type IIA and IIB-Fc fusion proteins by automated capillary immunoassay. Drug Test Anal. 2022 Oct 5. doi: 10.1002/dta.3378. Epub ahead of print. PMID: 36200177.
②Anemia in MDS-RS & Beta Thalassemia (BT) Treatment - REBLOZYL® (luspatercept-aamt)
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