二价siRNA治疗神经系统疾病进展--Digital Western案例分析

RNA药物治疗领域近年来取得了快速进展，特别是mRNA新冠疫苗带动了整个领域发展进步，更多RNA疗法进入到临床试验阶段。借助一些创新性检测技术，可加速RNA药物研发，特别是在RNA药物发现和临床前研究阶段，需要快速精准检测基因表达和蛋白质表达变化。全自动毛细管电泳Digital Western技术作为蛋白质表达定量领域的创新性工具，已被广泛用于ASO、siRNA、mRNA等不同类型RNA疗法，加速体外和体内药理药效实验。

美国麻省大学医学院科学家《Nature Biotechnology》研究发现，利用二价siRNA（di-siRNA）实现了小鼠和非人灵长类动物大脑内特定基因表达的持续调节，可用于中枢神经系统疾病治疗。Di-siRNA通过一个连接子连接两个完全化学修饰的含硫代磷酸脂siRNA构成。小鼠模型中，di-RNA诱导亨廷顿病的致病基因有效沉默，从而减少了整个大脑中mRNA和亨廷顿蛋白质表达。食蟹猴实验中，实现了整个大脑和脊髓中高效的基因沉默，而且没有可检测到的毒性和最小的脱靶效应。

采用Digital Western检测小鼠大脑不同脑区蛋白表达水平

通过合成可靶向htt mRNA的di-siRNA，在野生型小鼠纹状体内注射di-siRNA HTT可实现Htt mRNA表达下调，注射两周后纹状体和皮质中mRNA下调50%-75%，而非靶向对照（NTC）寡核苷酸没有影响靶基因表达。双侧ICV注射后一个月，di-siRNA在多个脑区（Hipp海马、Thal丘脑、Str纹状体、PC后皮质、MC内侧皮质）两个不同剂量条件下沈默HTT蛋白表达，与PBS对照和非特异性靶向相比，60 µg和475 µg都能导致Htt表达下调，475 µg高剂量给药时，可将这个大脑内HTT蛋白表达下调到低于检测水平。

载脂蛋白E（ApoE）与多种神经退行性疾病相关如阿尔兹海默症和肌萎缩侧索硬化症，设计靶向ApoE功能性di-siRNA序列，单次脑脊液注射可实现APEO蛋白高效沉默。与PBS对照和非特异性靶向RNA相比，475µg特异性靶向di-siRNA可高效实现不同脑区载脂蛋白E（APOE）表达沉默。

 二价siRNA沉默ApoE表达可改善阿尔兹海默症小鼠模型淀粉样蛋白病理症状

全自动毛细管Digital Western技术作为创新性毛细管电泳免疫学技术，将Western Blot技术和ELISA技术合二为一，具备传统WB蛋白质可视化定性的优势，同时具备ELISA免疫学实验精准定量能力，其灵敏度和精密度符合高标准生物分析要求，可利用微量组织样本实现内源性蛋白质精准定量。

此技术已广泛被核酸药物领域领导者采用，如mRNA药物Moderna、BioNtech和CureVac等，ASO药物Ionis Pharmaceuticals、Sarepta等，siRNA药物Alnylam、Dicerna和Arrowhead等，saRNA领域MiNA Therapeutics和中美瑞康等，及其他各种RNA疗法公司。

参考文献：

1. Alterman, J.F., Godinho, B.M.D.C., Hassler, M.R. et al. A divalent siRNA chemical scaffold for potent and sustained modulation of gene expression throughout the central nervous system. Nat Biotechnol 37, 884–894 (2019).

2. Ferguson C M, Hildebrand S, Godinho B M D C, et al. Silencing of ApoE with Divalent siRNAs Drives Activation of Immune Clearance Pathways and Improves Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer’s Disease[J]. bioRxiv, 2022.