2022-10-14 18:19:32, YoYo老师 三耀精细化工品销售(北京)有限公司
肌肽
L-Carnosine
MW:226.23
鹅肌肽
L-Anserine
MW:240.26
肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸,L-Carnosine),是由β-丙氨酸和L-组氨酸两种氨基酸组成的二肽;鹅肌肽(β-丙氨酰-1-甲基-L-组氨酸,Anserine),为高度稳定的水溶性二肽,天然存在于脊椎动物的骨骼肌组织和脑组织中。
客户提供了肌肽和鹅肌肽单标,希望本实验室建立液相分离方法。
由于肌肽和鹅肌肽二者结构只相差一个甲基,极性差异较小,因此分离难度相对较大。实验室的小伙伴尝试了多款色谱柱进行分析尝试,你猜最后谁赢了?下面就来看看吧~
酸性+纯水相
首先,尝试使用键合立体笼状结构金刚烷基官能团的高表面极性色谱柱——CAPCELL PAK ADME,在酸性纯水相条件下进行分析,发现肌肽和鹅肌肽出现分离趋势,但由于保留时间较短,无法达到有效分离,结果如图1所示。
▲图1 CAPCELL PAK ADME在酸性条件下分析结果
TFA+纯水相
为了延长保留时间,将0.1%磷酸水溶液更换为0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液,使用耐纯水的高极性色谱柱——CAPCELL PAK C18 AQ色谱柱进行分析,希望能在离子对试剂的作用下加强保留。
如图2,TFA条件下保留时间延长至4min,但分离趋势减弱;同时我们也将离子对试剂更换为辛烷磺酸钠,进一步延长了保留时间,但同样分离趋势不明显。
▲图2 CAPCELL PAK C18 AQ色谱柱在TFA条件下分析结果
HILIC模式
由于在酸性反相条件下保留时间较短未能得到分离,因此也考虑尝试使用HILIC模式加强保留。使用PC HILIC色谱柱在80%乙腈条件下进行分析,结果如图3所示,肌肽保留时间能够延长至10 min以上,但峰形较宽,无法得到二者分离。
▲图3 PC HILIC色谱柱分析结果
碱性+纯水相
综合考虑上述分析结果后,继续尝试在碱性条件(pH 9.0)使用反相色谱柱进行分析。由于流动相条件碱性较强,且不含有机相,因此首先使用了耐碱性较强的CAPCELL PAK C18 BB色谱柱进行尝试,如图4,在碱性条件下肌肽和鹅肌肽保留时间较长,且分离良好。
▲图4 CAPCELL PAK C18 BB在碱性条件下分析结果
中性+纯水相
然而,考虑到碱性的纯水相条件非常苛刻,即使使用耐碱性色谱柱进行分析,仍可能对色谱柱自身寿命造成不良影响,因此我们进一步尝试将流动相条件由碱性调整为中性,同时比较耐碱型色谱柱BB和耐水型色谱柱AQ的分析结果。如图5,在中性条件下,耐水型色谱柱AQ的保留及分离情况要优于BB色谱柱。
▲图5 中性条件下CAPCELL PAK C18 BB与AQ色谱柱分析结果对比
中性+高水相
最终,我们选择CAPCELL PAK C18 AQ色谱柱在中性分析条件下添加5%甲醇,同时优化柱温,得到最终分析结果如图6所示,肌肽与鹅肌肽之间分离度为2.82,能够达到基线分离。
▲图6 CAPCELL PAK C18 AQ色谱柱优化条件分析结果
注:峰上标数字为分离度。
综上所述,经过一系列色谱条件的调整和色谱柱的筛选,最终,使用能在纯水相条件下稳定使用的高极性色谱柱CAPCELL PAK C18 AQ S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm在中性高水相条件下可完成肌肽和鹅肌肽的良好保留与基线分离;实际样品分离过程中,客户可根据实际需要再做pH调整等措施来改善分离及保留。
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