2022-09-27 17:33:47, YoYo老师 三耀精细化工品销售(北京)有限公司
左卡尼汀(左旋肉碱)是哺乳动物能量代谢中必需的体内天然物质,机体自身可合成,主要功能为促进脂类代谢。
左卡尼汀
L-carnitine
M.W. : 161.2
客户提供已知结构中间体2和中间体3,以及成品左卡尼汀单标样品,希望能够建立中间体液相分析检测方法。
▲中间体2与中间体3结构式
由中间体结构式可知其紫外吸收较弱,因此首先使用二极管阵列检测器(PDA)对其紫外吸收进行确认。
紫外吸收光谱图如图1及图2所示,二者均为短波长吸收,最大吸收波长分别为195 nm和194 nm,最终选择的紫外检测波长为195 nm。
▲中间体2与中间体3的紫外吸收光谱图
接下来进行液相方法的建立。考虑到中间体的极性较强,故首先使用具有超高表面极性的反相柱CAPCELL PAK ADME,在100%水相条件下进行保留尝试,缓冲盐选择在低波长干扰较小的高氯酸钠体系。分析结果如图3所示,两中间体在反相系色谱柱上均无法得到保留,反相系色谱柱不适用于该项目分析。
▲图3 CAPCELL PAK ADME色谱柱分析结果
接下来,考虑利用阳离子交换模式和亲水性相互作用模式进行分析,以期得到良好保留和峰形。经过多方条件调整,最终在亲水性相互作用色谱柱PC HILIC上得到良好保留结果。中间体分析谱图及放大图分别如图4-7所示。
中间体在高氯酸钠体系条件下得到良好峰形,同时与死时间附近杂质峰取得了良好分离。应客户要求对其杂质进行了积分,积分表分别如表1-2所示(软件自动积分结果)。
▲图4 中间体2分析结果
▲图5 中间体2分析结果放大图
▲表1 中间体2分析结果积分表
▲图6 中间体3分析结果
▲图7 中间体3分析结果放大图
▲表2 中间体3分析结果积分表
同时,我们也使用PC HILIC色谱柱进行了两中间体的共同分析,以期得到二者的基线分离结果,简化分析过程。然而在HILIC模式下,由于乙腈比例较高,且中间体自身需要在短波长下检测,因此可选的缓冲盐浓度及种类均有限;水相分别尝试使用0.1%磷酸溶液、20 mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH 2.5)、20 mmol/L磷酸二氢铵溶液(磷酸调pH 2.5)及不同浓度高氯酸钠溶液,结果均无法得到两中间体的分离;且在盐浓度不足时,中间体由于自身的季铵盐结构易产生吸附作用,很难得到良好峰形,典型谱图如图8所示。
▲图8 0.1%磷酸条件PC HILIC分析结果
此外对柱温进行筛选,温度升高时保留时间有缩短趋势,但未见二者出现明显分离趋势,结果如图9所示。
▲图9 不同柱温分析结果
考虑到中间体的整体紫外吸收较弱,应客户要求,使用高灵敏度气溶胶型检测器NQAD进行了分析对比。
由于气溶胶型检测器NQAD要求流动相必须为挥发性盐,因此将水相中的高氯酸钠更换为50 mmol/L甲酸铵溶液(+0.1%甲酸)进行分析,中间体2、中间体3、左卡尼汀共同分析结果如图10-12所示。
▲图10 中间体2在NQAD检测器分析结果
▲图11 中间体3在NQAD检测器分析结果
▲图12 左卡尼汀在NQAD上分析结果
由于5 mg/mL样品浓度较大,在NQAD检测器上过载,出现信号平头峰或裂峰现象,把浓度稀释10倍后可得到正常峰形。
但即使在大浓度样品分析中,未见死时间附近出现明显杂质峰,推测原因可能为杂质分子量较小,为挥发性杂质,无法在气溶胶型检测器上进行良好检出。此外,能够看到中间体在NQAD检测器上均出现多个明显色谱峰。
由于使用NQAD进行检测时,中间体均出现溶出多个色谱峰现象,怀疑为中间体的成盐离子导致,因此小浓度进样NaCl溶液进行了排查,对比结果如图13所示。
▲图13 不同样品NQAD比较图
NaCl保留时间和较大杂质峰保留时间一致,可能为相应对离子。此外,在NQAD系统使用的甲酸铵流动相体系下,中间体2和3得到了分离。
综上所述,使用大阪曹達PC HILIC色谱柱可完成左卡尼汀中间体及成品的保留,在紫外检测条件下获得较好峰形结果,能够与死时间附近的杂质峰取得良好分离;同时,在NQAD检测器上,能够获得中间体的拆分结果(该流动相条件由于有机酸盐的掩盖作用,无法平移至紫外检测器进行分析)。
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