Nature Communications|cAMP抑制剂治疗黑素瘤机制，BD Rhapsody又来了！

2022-09-20 10:40:05, 小海胆上海吉凯基因医学科技股份有限公司

单细胞RNA测序技术已经越来越多的被应用于抗肿瘤的研究中，对于黑色素瘤，小编之前分享过一篇关于过继T细胞疗法的文章，今天继续带来一篇发表在Nature communications题为《Therapeutic melanoma inhibition by local micelle-mediated cyclic nucleotide repression》的通过微粒胶进行抗黑素瘤治疗的高分文章，希望能为老师们的相关研究带来补充。

背景介绍

在免疫系统中，细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平的增加抑制固有和适应性免疫细胞功能。调节性T细胞利用这种效应，通过cAMP传播抑制其他免疫细胞。黑色素瘤内cAMP水平升高与黑色素瘤生长、免疫抑制和转移相关，作者认为cAMP通路可能是治疗干预黑色素瘤生长的靶点。

临床发现，癌症可能通过免疫逃逸等机制来抵抗免疫攻击，限制治疗的有效性。作者发现黑素瘤的酸性肿瘤微环境，会通过上调肿瘤浸润单核细胞的cAMP来驱动免疫逃逸。作者将腺苷酸环化酶抑制剂MDL整合到多肽共聚物微粒胶中，进行抗肿瘤治疗，单细胞测序结果显示其减少了抗炎髓细胞的数量和T细胞的免疫检查点受体表达丰度，可以恢复抗肿瘤免疫。

技术亮点

BD Rhapsody单细胞仪器、试剂盒及分析平台：

BD Rhapsody Single-cell Analysis System
BD Rhapsody小鼠多样本标签试剂盒（mouse single cell multiplexing kit）
BD Rhapsody全转录组试剂盒
BD Rhapsody Analysis Pipeline

BD FACS流式细胞仪：

BD FACS Aria III flow cytometer、BD LSRII flow cytometer

实验设计

主要结论

多肽共聚物微粒胶的安全性和有效性

为了确保药物的安全性，作者在黑素瘤周围，分别注射了NL-PM（未整合MDL的多肽共聚物）、L-PM（整合了MDL的微粒胶）、游离药物（MDL）或其溶剂（DMSO），测定黑色素瘤中死亡细胞的频率。联合annexin V/7-AAD和细胞表面标记物在注射后1 h和4 h染色，发现高剂量MDL注射后有部分细胞死亡，相等计量的L-PM是无毒的（图1），表明L-PM避免了抑制剂的毒性作用。同时作者也测试了只有L-PM条件下cAMP水平最低、效果最佳（图2）。

图1

图2

微粒胶的滞留和渗透

为了检测微粒胶在组织中的滞留和渗透情况，作者在C57BL/6小鼠皮下生长14天的B16F10- OVA黑色素瘤瘤周（图3，不是瘤内，所以没有损伤瘤组织）注射了Oregon-绿色标记的L-PM，在1和24小时后分析了染料在不同组织中的分布。在1h内，微粒胶几乎只存在于肿瘤组织中，被CD45+细胞和非造血CD45-细胞吸收，在免疫细胞中，微粒胶选择性与髓系(CD11b+)细胞相互作用，在24h后，肾脏中也发现了荧光颗粒(图4、5)。

图3

图4

图5

微粒胶持续抑制cAMP水平及免疫浸润相关性

为了确保对肿瘤组织中cAMP形成的持续抑制，在肿瘤明显可见时就开始注射(接种后大约第4天)，每隔一天注射一次药物，注射L-PM的小鼠黑素瘤生长显著降低(图6)。为了缩小靶细胞范围，作者对缺乏适应性免疫细胞的RAG敲除鼠进行实验，与正常鼠相比，L-PM治疗不能抑制缺陷小鼠黑素瘤的生长(图7)，表示免疫浸润对该抗肿瘤作用似乎是必不可少的。

图6

图7

Treg/cAMP联合干扰实现黑素瘤排斥反应

作者进一步剖析了Treg细胞在其中的作用。在适应性免疫细胞中，Treg细胞内cAMP水平升高，通过 gap junction传递cAMP来调节其他免疫细胞，FOXP3突变小鼠中无功能Treg细胞的cAMP水平显著降低。

Foxp3+ Treg的选择性缺失是提高抗肿瘤治疗效果的一种非常有效的策略，作者发现在Treg减少（DT）的DEREG小鼠中，减少Treg可以与L-PM协同治疗(图8)，实现了完全的肿瘤排斥反应。

图8

单细胞测序揭示cAMP抑制微粒胶可防止肿瘤免疫

细胞功能障碍

为了研究cAMP抑制是如何实现有效的抗肿瘤免疫，作者将对照组（NL-PM）和治疗组（L-PM）的小鼠黑色素瘤中所有CD45+细胞进行了单细胞mRNA分析（见实验设计部分）。

在细胞类型上，鉴定出B细胞、树突状细胞(DC)、浆细胞样树突状细胞(pDC)、巨噬细胞/单核细胞(Macro /Mono)、中性粒细胞、NK细胞和T细胞。在治疗组中，虽然B细胞、巨噬细胞/单核细胞和中性粒细胞数量减少，但L-PM中细胞毒性NK和pDC细胞显著增加(图9)。作者进一步分析了骨髓细胞中与免疫抑制或激活状态相关的基因表达，发现巨噬细胞/单核细胞以及中性粒细胞中Ptgs2、Vegfa(血管内皮生长因子A)、Egfr(表皮生长因子受体)、Arg1(精氨酸酶1)、Ccl22、Ccl17、Il1rn、Il10和Il12a表达下调（图10）。

重要的是，肿瘤中免疫抑制的髓细胞使T细胞进入功能失调状态，NL-PM组免疫检查点上调，L-PM组中Lag3、CTLA-4、Pdcd1 (PD-1)、Havcr2 (TIM3)表达显著减少 (图11)。这些数据支持了微粒胶介导的cAMP形成抑制，有助于免疫系统通过保护黑色素瘤组织中免疫细胞的功能来对抗黑色素瘤。

图9

图10

图11

讨论

作者用两种处理，即载有腺苷酸环化酶抑制剂MDL的微粒胶治疗和对照组，对小鼠黑素瘤的抗肿瘤机制进行了单细胞转录组水平等研究，分析了两组中细胞比例的变化及免疫检查点的表达变化。同时阐明了Treg细胞耗尽与cAMP抑制剂联合治疗的有效性。使用载有抑制剂的聚合微粒胶局部抑制cAMP可降低黑色素瘤的生长，为开发优化的局部黑色素瘤免疫疗法提供了依据。

参考文献：Johann K, Bohn T, Shahneh F, et al. Therapeutic melanoma inhibition by local micelle-mediated cyclic nucleotide repression [J]. Nature communications.