小心“茶中毒”！曝光咖啡因含量测定全过程！

2024-02-22 22:49:06 阿斯曼尔科技（上海）有限公司

咖啡因介绍

咖啡因是从咖啡或茶叶中提取的生物碱，具有兴奋中枢神经系统的作用，但长期或超量摄入有害。茶饮料中常含咖啡因，因此检测其含量至关重要。《茶饮料》标准中有相关规定。本文基于国家标准方法，结合阿斯曼尔设备，建立了一套快速、高效的茶饮料咖啡因含量测定法，采用HPLC分析和外标法定量，并通过加标回收验证，利用全自动液体工作站改善实验结果。

关键词

茶饮料，含量测定，咖啡因，液体工作站，HPLC

仪器及耗材

仪器：

FlexStation P4-S1全自动液体工作站

高效液相色谱仪（岛津 SPD-20A）

液相色谱柱(C18）或同等性能的色谱柱

0.22μm微孔水相滤膜(上海安谱)

电子天平(精度0.1 mg，赛多利斯)

耗材：

茶饮料(购自某超市)

甲醇（HPLC级，麦克林）

纯水

甲醇中咖啡因标准溶液（500 mg/ml ，北方伟业）

氧化镁(AR级，鼎盛鑫化工)

实验步骤

咖啡因标准溶液的配制

以500 μg/ml咖啡因标准溶液为源液，纯水定容，于室温平衡后用P4-S1的外标曲线功能配制成浓度分别为1、5、10、20、40、100和200 μg/ml的系列标准溶液。

试样处理

准确称取5g(精确至0.001g)样品，加纯水定容至10ml(使样品溶液中咖啡因含量在标准曲线范围内),摇匀，加入0.5 g氧化镁，迅速上下振摇，使氧化镁和待测茶饮料充分混匀，静置待上层澄清，取1ml上清液经0.22μm微孔滤膜过滤待测。

液相色谱条件

色谱柱	C18柱，250mm*4.6mm 5μL
参数	时间	滚动相	流速
	0-13 min	甲醇/纯水=30/70	1.0ml/min
	13.1-15 min	甲醇/纯水=30/70->100/0	1.2ml/min
	15.1-19 min	甲醇/纯水=100/0	1.2ml/min
	19.1-20 min	甲醇/纯水=100/0->30/70	1.2ml/min
	20.1-25 min	甲醇/纯水=30/70	1.0ml/min
监测波长	272nm
进样体积	10μL
柱箱温度	35℃

实验结果

标准物质的定性和定量

按照上述检测波长和流动相条件，用5 μg/ml的咖啡因标准品进行定性，进样量10 μl。标准溶液的色谱图见下图。咖啡因的出峰时间为5.258 min, 且标准品峰形对称。

标准溶液色谱图

线性关系考察

将配制的质量浓度为1、5、10、20、40、100和200 μg/ml的标准系列溶液按照2.3液相色谱条件上机测试，咖啡因的质量浓度(x)为横坐标，其对应测得的色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算曲线方程和线性系数。如图所示。图中表明咖啡因在1～200 μg/ml范围内有良好的线性关系。按照国标《食品安全国家标准饮料中咖啡因的测定》(GB 5009.139—2014)的方法中茶饮料的称样量和定容体积，代入国标方法的计算公式可得，茶饮料的检出限均为0.6 mg/kg, 定量限为2 mg/kg。

咖啡因标准曲线图

加标回收率

称取9份阴性茶饮料，结合方法的线性范围向1～3号试样中添加0.5 mL浓度为1.96 μg/mL的咖啡因标准溶液，按照试样处理过程操作，液相色谱条件测试，计算方法的加标回收率。向阴性茶饮料中添加0.15 mL浓度为1963.04 μg/mL的咖啡因标准溶液，平行测定6次，考察方法的重复性(用相对标准偏差RSD表示)，方法的重复性RSD为1.56%，具体见下表。由此可见，方法的加标回收率与重复性均满足GB/T 27404—2008中的规定，测定结果准确可靠。

序号	本底含量 μg/mL	加标量 μg/mL	取样量 g	定容体积 mL	测量值 μg/mL	回收率 %
1	0	10	5.0030	10	2.0740	96.43
2	0	10	5.0420	10	2.0280	98.62
3	0	10	4.9990	10	2.0416	97.96
4	0	20	4.9890	10	13.2961	100.28
5	0	20	5.0520	10	13.3174	100.12
6	0	20	5.0910	10	12.9061	103.31
7	0	40	5.1030	10	13.2948	100.29
8	0	40	5.0010	10	13.3080	100.19
9	0	40	5.0019	10	13.3494	99.88