精彩回顾—2018年清华大学MST技术培训

2018年11月28日，清华大学与NanoTemper合作开展了关于MST (MicroScale Thermophoresis，微量热泳动）技术的培训讲座，旨在让同学们更深入地了解MST技术和其应用。

此次活动主要分为技术讲座和实验演示两个主要环节。在讲座环节中，NanoTemper的技术专员与同学们共同讨论了有关MST技术的原理及应用。同学们积极发言和踊跃提问，也使我们收获良多。进行操作演示，进一步地为同学们展现了Monolith NT.115型号仪器的便捷使用方法和强大软件功能。

下面就请跟随小编一起回顾下培训的精彩内容吧！

什么是MST技术？

MST（MicroScale Thermophoresis，微量热泳动），是指分子在温度梯度场中定向移动的一种现象，可以作为一种定量分析生物分子间相互作用的有效手段。

MST 测试时，利用红外激光建立微观温度梯度场，对样品中一个分子进行荧光标记，通过信号追踪来探测和量化分子在微观温度梯度场中的定向移动。MST有效地结合了荧光检测的精准性与热泳动的灵活性及灵敏度，高效、可信地检测分子间相互作用。

MST应用范围？

MST的应用范围广泛，可用于检测蛋白与小分子之间、蛋白和蛋白之间、多蛋白复合物之间的相互作用。MST 可以在溶液中直接进行测定，无需任何表面固定，因此即使对于体积较大、不稳定的样品，比如脂质体、纳米材料或者膜蛋白，也同样适用。

在此小编和大家分享一些研究者使用MST进行实验的经典案例吧~

NRT1.1是拟南芥中的一种分子量很大且具有多个跨膜螺旋的蛋白，对于硝酸盐信号控制非常重要，但是由于自身结构的独特性，传统方法无法检测到蛋白与硝酸根的结合。2014年牛津大学的研究人员[1]利用MST技术，不仅检测到了结合后分子量大小及电荷的变化，而且观察到了结合前后蛋白分子构象的差异。

[1] Parker, J.L. and Newstead, S. Molecular basis of nitrate uptake by the plant nitrate transporter NRT1.1. Nature 507, 68–72. 

北京化工大学冯越教授[2]实验室应用MST技术研究了SdeA蛋白及其突变体与NAD+之间的相互作作用。发现R729A和R766A突变体完全丧失了与底物小分子的结合能力。该研究为设计针对该家族蛋白的小分子抑制剂，作为治疗军团菌肺炎的潜在抗生素奠定了重要基础。

[2] Dong, Y. et al. Structuralbasis of ubiquitin modification by the Legionella effector SdeA. Nature 557, 674–678.

CRISPR-Cas系统是细菌编码的适应性免疫系统，通过RNA引导的效应蛋白剪切病毒的DNA或RNA来抵抗病毒感染。

哈尔滨工业大学的黄志伟教授课题组[3]发现了crRNA和蛋白Cpf1复合物的晶体结构，发现六水合镁离子与crRNA紧密结合对稳定crRNA构想至关重要。MST测试结果表明缺失镁离子后，Cpf1与crRNA的亲和力下降了约70倍。

[3] Dong, D. et al. The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA. Nature 532, 522–526.

传统SPR、ITC等分子互作研究方法需要对蛋白进行纯化，不但费时还会大量消耗样品。MST技术可以直接在细胞裂解液中进行检测，免去繁杂的纯化步骤。

NanoTemper推出的RED-tris-NTA染料具有超高的亲和力，可特异性结合His Tag，可对细胞裂解液等复杂生物溶液中直接标记带有His Tag的蛋白。

Bartoschik[4]等人将表达p38α-6Xhis蛋白的细胞裂解后，直接讲裂解液与RED-tris-NTA染料混合孵育30 min完成蛋白标记。实验结果测得p38与化合物SB203580的亲和力为116 nM。

[4] Bartoschik, T. et al. Near-native, site-specific and purification-free protein labeling for quantitative protein interaction analysis by MicroScale Thermophoresis. Sci. Rep. 8, 4977.

NanoTemper Monolith系列的实验操作流程复杂吗？

Monolith不但操作简便，而且与其他传统检测方法相比，毛细管的使用具有众多优势：无需对样品进行固定，无需纯化蛋白，样品消耗量极少，无惧有机溶剂，价格低廉等。

样品处理时需要注意什么？

标记策略：需要根据不同的检测样品选择不同的标记策略。我们提供一系列的蛋白标记试剂盒，针对不同的蛋白采用相应的标记策略，主要分为四类：赖氨酸的自由氨基、半胱氨酸巯基、抗体、标记His标签）；

荧光分子浓度：低于预期的Kd值；

配体分子的最高浓度：高于预期Kd的20倍；

样品体系：建议20 µL，可以使用PCR管进行样品稀释；

尽量避免溶液中引入DMSO，但若实验需要引入助溶剂，我们建议在标记反应中保持DMSO浓度在5%以下，以免对蛋白造成损害，且保证每个毛细管中的溶液状态一致；

操作时用移液枪轻轻吸打混匀，不要使用涡旋震荡；

不要用手触碰毛细管中间部位以免影响实验结果。

仪器都有哪几种检测模式？

Pretest：检测样品是否达到检测要求

Binding Check：快速定性检测两个分子是否相互作用

Binding Affinity：定量测定两个分子的结合亲和力

Expert Mode：自定义模式，更自由的设定实验参数，建议高阶用户使用

通过此次活动，NanoTemper有机会与同学们共同探讨有关MST技术和应用的相关问题。我们也在活动中不断地成长和进步。如果想要了解更多MST数据分析及优化策略的知识，或想与我们一同探讨实验中的小问题，欢迎大家随时联系我们！

更多NanoTemper产品信息，请戳“阅读原文”。