Make it Evident丨STTT 揭示狼疮脑损伤机制研究新进展

     Make it EVIDENT     

本期推出【SpinSR Makes Synapse Evident】

南京大学附属鼓楼医院/南京中医药大学 

孙凌云/胡刚团队

补体信号与神经精神狼疮

系统性红斑狼疮（SLE）是一种难以治愈的自身免疫性疾病，40-90% 的患者会出现神经精神症状，表现为焦虑、抑郁和认知障碍等，称为神经精神狼疮（NPSLE）。

既往观念认为NPSLE是系统性免疫持续激活累及中枢神经系统（CNS）的后果，然而，针对这些认识的治疗（免疫抑制剂及激素）并不能遏制病情进展，长期使用还易产生多种不良反应。研究表明，神经症状多出现在SLE病程早期，提示脑内早发致病因素的存在。靶向这些因素的发现，是深化疾病认知和治疗学突破的关键。

补体蛋白C1q是经典补体信号的启动因子。最近研究发现脑内C1q具有独特的生物学功能，可以调控小胶质细胞对神经突触的修剪，对神经环路的精准发育及衰老、阿尔茨海默病、精神分裂症等病变过程中的突触丢失至关重要。但对于其在NPSLE中的效应，仍然知之甚少。

神经元-补体-小胶质细胞突触修剪调控神经精神狼疮

2022年2月18日，南京大学孙凌云教授与南京中医药大学胡刚教授团队合作，在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=38.104）上以长文形式发表题为Neuronal NR4A1 deficiency drives complement-coordinated synaptic stripping by microglia in a mouse model of lupus的研究论文，提出神经突触丢失是NPSLE早期脑内病理，其机理系通过神经元Nr4a1-C1q-小胶质细胞协同调控的突触修剪。

研究团队首先利用自发狼疮的MRL/lpr小鼠模型，利用综合行为学分析系统进行动态评估，发现改模型小鼠在狼疮病程早期（系统性病理改变及肾脏损伤之前）就已出现显著的焦虑行为。同时模型小鼠海马和皮层的小胶质细胞激活。这一发现提示脑损伤发生在狼疮病程的早期，脑内小胶细胞激活可能参与狼疮脑损伤的病理进程。

MRL/lpr小鼠早期（6周龄）时出现焦虑行为（上图）

伴海马小胶质细胞激活（下图）

为了明确模型小鼠出现焦虑行为时脑内病理改变的分子机制，研究团队对小鼠海马组织进行RNA测序。作者发现，MRL/lpr小鼠海马小胶质吞噬基因激活，伴随补体信号上调，同时神经突触传递、LTP信号被抑制。

MRL/lpr小鼠海马屯胶质吞噬信号、补体信号激活，突触传递、LTP信号抑制

为了进一步确定小胶质细胞吞噬激活、突触功能异常在NPSLE中的作用，作者通过超分辨显微成像，发现模型小鼠海马突触蛋白（SYN,突触前膜; PSD-95,突触后膜）荧光密度显著减少。STED显微镜结合Imaris分析显示，活化的小胶质细胞吞噬神经突触增多。进一步利用药理学方法抑制小胶质细胞吞噬功能，可以显著缓解MRL/lpr小鼠海马突触丢失及焦虑行为。

MRL/lpr小鼠海马突触蛋白荧光信号显著减少（上图）

（使用Olympus SpinSR活细胞超分辨转盘共聚焦显微成像系统拍摄）

为了进一步明确C1q在小胶质细胞突触吞噬中的作用，研究团队首先通过显微成像研究发现小鼠海马升高的C1q多定位于突触末端。作者进一步利用中和抗体特异性阻断小鼠海马C1q信号，发现C1q阻断可缓解狼疮小鼠的神经损伤。提示小胶质细胞突触修剪和C1q信号共同参与NPSLE的发病。

C1q主要定位于突触末梢，利用中和抗体阻断脑内C1q信号可以缓解狼疮小鼠的神经损伤

除了小胶质细胞修剪外，突触结构或神经元内在电活性的改变也参与突触密度的调节。但对于神经元如何与小胶质细胞沟通并协同调控突触丢失，仍然知之甚少。

接下来，研究团队对突触修剪的神经元调控机制进行了探究。通过对MRL/Lpr小鼠海马组织转录组测序，筛选出了潜在效应信号分子-Nr4a1。

有趣的是，抑制神经元的兴奋性可以减少Nr4a1的表达，与文献报道的降低的神经元电活性促进小胶质细胞突触修剪的理论一致，支持Nr4a1参与狼疮脑内突触吞噬的作用。为了确认Nr4a1的具体调控机制，团队制备了神经元-小胶质细胞共培养模型，并利用敲减慢病毒在原代神经元中干扰Nr4a1表达，明确神经元Nr4a1信号减弱导致突触骨架蛋白异常，作为桥梁信号促进C1q的突触定位，并被活化的小胶质细胞识别吞噬。

在原代神经元中敲减Nr4a1科减少C1q的突触定位

下一步，团队对Nr4a1调控狼疮脑损伤的体内作用进行了探究。团队利用先前确定的海马立体定位注射技术和过表达慢病毒，在模型小鼠海马神经元中过表达Nr4a1。

利用这一方法，团队证明了海马神经元Nr4a1是调控C1q定位及小胶质细胞定向突触修剪介导NPSLE发病的关键信号。

海马神经元特异性过表达Nr4a1缓解狼疮脑损伤

（突触荧光信号图 使用Olympus SpinSR活细胞超分辨转盘共聚焦显微成像系统拍摄）

因此，该研究应用多种模型及研究方法，阐明了突触丢失是狼疮脑损伤的早期病理，小胶质细胞、补体信号、神经元共同参与该过程。

同时，该工作首次揭示神经元内在Nr4a1异常在调控C1q-小胶质细胞“突触修剪”中的主动作用。为狼疮脑损伤及相关疾病的早期干预提供了新策略及新靶点。

Nr4a1-C1q-microglia 调控突触修剪参与NPSLE发病机制的示意图

在本次研究中，小鼠海马突触蛋白荧光标记图片使用了Olympus SpinSR活细胞超分辨转盘共聚焦显微成像系统拍摄，该系统无需特殊标记手段即可实现低至110nm的XY分辨率，成像速度可达200pfs，适合进行快速图像拼接及低光毒性延时成像，更有利于在较大的范围内观察标本或者对活体样品进行长时间观察。在此，感谢Evident江苏省代理商 南京奥力科学仪器有限公司市场部 毛雨 对实验的大力支持。