Biomek i3自动化细胞转染DOE：提升准确性和重现性

实验变量多：铺板密度、DNA负载、转染试剂体积、孵育时长、加样位置/速度、混匀方式等，手工难以保持跨板一致。

时序难统一：DNA+P3000与Lipo的孵育/混合到加样的时间差，将影响表达水平。

细胞铺板：HEK293，96孔平底黑壁透底板；铺板密度25,000/50,000 cells/100 μL，按列分布以便条件对比；铺板后用i3X MiniMax成像确认沉降与状态。

转染体系：依据试剂说明，比较DNA 100 vs 400 ng/孔；Lipo 0.15 vs 0.3 μL/孔；P3000比例按说明书添加；Opti-MEM为稀释体系。

关键时序：对每种预混体系自动错开启动，使“混合→有效载荷加样”的孵育，统一为12分钟；有效载荷液面下约1 mm加样；缓慢吹吸+倾斜混匀。

培养与检测：转染后37°C，5% CO₂培养；用EVOS（明场+GFP）保持一致参数成像；再以CytoFLEX流式细胞分析仪进行定量。

过高DNA浓度可能导致细胞毒性。检测数据结果支持这一假设，在400ng条件下，无论是在定性荧光成像分析还是定量流式细胞术数据中，转染效率都有所降低。

在考虑Lipofectamine的剂量时，我们没有观察到0.15 μL和0.3 μL在下游转染效率方面存在显著差异，但50000个细胞接种密度和高DNA浓度加入的情况除外。未来的实验可能考虑降低Lipofectamine浓度来减少昂贵试剂的消耗，并通过在25000个细胞密度下接种来减少总细胞需求。